多肽合成知识介绍

多肽合成知识介绍

1．多肽合成的基本原理

多肽固相合成法是多肽合成化学的一个重大的突破。它的最大特点是不必纯化中间产物，合成过程可以连续进行，从而为多肽合成的自动化奠定了基础。目前全自动多肽的合成，基本都是固相合成。基本过程如下：

基于Fmoc化学合成，先将所要合成的目标多肽的C-端氨基酸的羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连，然后以这一氨基酸的氨基作为多肽合成的起点，同期它的氨基酸的羧基（已经活化）作用形成肽键，不断重复这一过程，即可得到目标多肽。根据多肽的氨基酸组成不同，多肽后处理方式不同，纯化方式也有差异。

2．关于Antigen Grade 多肽必须在在多肽的一端增加 Cysteine吗？

答：不一定，偶连的方式与偶连的活化剂和氨基酸组成有关。EDC: 通过C端 COOH连接，一般要求序列中无Glu (E), Asp (D),或an amidated C-terminus；Act. EDC Method: 通过 N端的氨基偶连，要求序列中无Lys (K) 或N端没有被乙酰化；MBS:通过Cys的基团载体中其他 SH连接形成 S-S. 如果序列中无Cys,就需要添加Cys基团，最好增加在N端。

3．制备多肽抗体，常用的载体有那些？如何选择？

答：多肽分子量很小，免疫应答效果差,需要与载体偶连以提高免疫源性。载体大多数为高分量的蛋白质，常用的载体有KLH (铜蓝蛋白)，BSA, OVA等。KLH为首选。 ELISA测定多肽抗体效价时，有些多肽直接包板有困难，需要与BSA等偶连后再包板。

4．做免疫用的多肽多长为合适？

答：10-15个氨基酸，当然长一些免疫效果好一些，不过合成费用会上去。10aa以下的多肽免疫效果比较差。

5．为什么多肽抗体有时不能用于Western Blot?

答：这比较常见，Elisa一般都没有什么问题。

6．免疫用多肽的纯度要很高吗？

答：纯度高当然好，但是代价也高。问题是如果纯度为90-95%的多肽能产生抗体，65-75%纯度的多肽，一般也不对失败。

7．我们合成的多肽溶解性如何？

答：很难准确预测一个多肽的溶解性及合适的溶剂是什么。如果多肽难以溶解就认为多肽合成有问题就大错特错了。那么如何判断多肽的溶解性？

8．多肽状态如何？如何保存储存？

答：我们提供的多肽是粉末状，一般为灰白色，组成不同，多肽粉末的颜色有差异。多肽一般需要避光保存。长期保存应保存在-20度，短期可以保存在4度。可以短时间室温运输。

9．多肽的量是怎么确定？

答：一般用天平直接称重。

10．如何溶解多肽？

答：溶解多肽是非常头痛的事情，一般很难一下子确定合适的溶剂。通常是先取一点试一试，在没有确定合适的溶剂前千万不要全部溶解。

下列方法有助于您选择合适的溶剂。

（1）判定多肽的电荷特定，设定酸性氨基酸Asp (D), Glu(E)和C端COOH为-1；碱性氨基酸Lys(K),Arg(R), His (H)及N端NH2为+1，其他氨基酸的电荷为0。计算出净电荷数。

（2）如果净电荷数>0,多肽为碱性，用水溶解；如果不溶解或溶解性不大，加入醋酸（10%以上）；如果多肽还不能溶解，加入少量 TFA(25ul)溶解，然后加入500ul水稀释。

（3）如果净电荷数<0,多肽为酸性，用水溶解；如果不溶解或溶解性不大，加入氨水(25ul)溶解，然后加入500ul水稀释。

（4）如果净电荷数＝0,多肽为中性，一般需要用有机溶剂如乙腈，甲醇或异丙醇，DMSO等溶解。还有人建议需要假如尿素等溶解疏水性很大的多肽。

11．不同纯度级别多肽的使用领域是什么？

答：不同纯度级别多肽的使用领域并不相同。

(1) 粗品和脱盐级别的纯度和多肽的长度有关，Fmoc固相多肽合成每个氨基酸的偶连效率在95%

以上，下表列出了每步合成的产率，可以帮助您判定粗品和脱盐级别是否适合您的用途，从而节省开支。

(2)多肽合成有一个重要的用途是用来免疫抗体，一般情况下免疫级65-75%左右纯度的多肽就达到免疫的要求。如果纯度为90-95%的多肽能产生抗体，65-75%纯度的多肽，一般也不会失败。纯度高当然好，但是代价高时间也相对较长。Elias 测定抗体效价时，同样70%左右的纯度就可以满足。（3）研究级80%以上纯度的多肽可以用于酶底物定性研究、体外生物活性分析，免疫封闭、磷酸化研究、亲和层析，单抗制备等研究

（4）90%以上的纯度可以用于包括细胞体内外活性分析，定量分析等大多数研究。 NMR研究的纯度需要达到95%以上。

12．非HPLC纯化的多肽中有那些杂质？

答：粗品和脱盐级别的多肽中多肽和非多肽类杂质：如非全长肽和多肽后处理的一些原料如DTT、TFA等。

13． HPLC纯化的多肽有那些杂质？

答：经过HPLC纯化的多肽，即使是简单的纯化，其中的杂质主要是短肽和微量 TFA.

14．多长的多肽为合适？

答：根据多肽合成需要多肽的长度，电荷，亲疏水性等因素。长度越长，合成粗品的纯度和产率都随着降低，纯化的难度和无法合成的几率就会大些。当然多肽功能区的序列是无法改变的，但是为了多肽的顺利合成，有时不得不在功能取的上下游增加一些辅助氨基酸，以改善多肽的溶解性和亲疏水性。如果多肽太短，合成也可能有问题，主要问题是合成的多肽在后处理过程中有一定的难度，5肽以下的多肽，一般要有疏水的氨基酸，否则后处理难度加大。15个氨基酸残基以下的多肽一般都可以得到满意的产率和得率。

15．如何从多肽序列中判定多肽的溶解性？

（1）多肽中如果含有高比例的疏水性很强的氨基酸如Leu, Val, Ile, Met, Phe 和 Trp，多肽很难溶解与水性溶液中或根本不可能溶解。这些氨基酸无论是纯化或合成，都有可能有问题。

（2）一般情况下疏水性氨基酸的比例<50%, 不能连续5个连续aa为疏水性，带电荷的氨基酸的（正电荷K, R, H, N-terminus，负电荷 D, E, C-terminus）的比例达到20%，在多肽的N或C短如果能增加极性氨基酸，也可以改善溶解性。

16．为什么含有Cys, Met, 或 Trp的多肽难合成？

答：含有Cys, Met, 或 Trp的多肽难以合成，同时难以获得高纯度的产品。主要因为这些基团不稳定，易氧化。这些多肽的使用和储存都需要特别注意，避免反复开启盖子。

17．为什么有些多肽的合成产率或纯度会比较低？

答：多肽合成与引物合成有比较大的区别，不能的引物合成很少，但是不能合成的多肽经常有。如Val, Ile, Tyr, Phe, Trp, Leu, Gln, 和Thr这些氨基酸比邻或重复时，多肽链在合成过程中不能完全舒展溶解，合成效率下降。下列几种情形，合成效率和产物的纯度都比较低：重复 PRO，Ser-Ser, 重复Asp, 4个连续 Gly 等。

18．多肽是如何纯化的？

答：多肽纯化一般使用反相柱（如C8, C18等），214nm。制备多肽时可以根据需要使用制备和半制备柱。缓冲体系通常为含TFA的溶剂，pH2. Buffer A为0.1% TFA 去离子水配制，Buffer B为.1% TFA /ACN /pH 2。纯化前用Buffer A溶解；如果溶解不好，用buffer B溶解后，然后用Buffer A稀释；对疏水性强的多肽，有时还需要加入少量的Formic Acid或醋酸。 HPLC分析多肽粗品，如果多肽不长（15aa以下），一般有主峰，主峰通常为全长产物；对于20 aa以上的长肽，如果没有主峰，HPLC和MS必须结合起来，判定分子量，从而确定哪个峰是目标多肽。

19．含 Cys的多肽如何处理？

答：含Cys 的多肽比较容易氧化。多肽纯化过程中一般都是在pH2的酸性条件性完成的，这种条件下Cys 的SH,基本保持还原状态，不需要特殊的后处理。当然含 Cys的多肽会慢慢的氧化，氧化的速度取决于保存条件和序列组成。如果是需要 cys形成S-S，纯化一般需要在碱性或中性条件下纯化。