《生物化学实验指导》PPT课件

称10g CM—纤维素干品置于烧杯中，加 入100ml 0.5mol／l NaOH—0.5mol从NaCl溶 液，混匀，静置15min后，在布氏漏斗中抽 滤，水洗滤饼至中性。此滤饼再悬浮于 100m1 1mo1／l HCl溶液中，混匀，静置 10min后放入布氏漏斗抽滤，水洗滤饼至中 性。再将滤饼悬浮于100m1 0.5mo1／l NaOH—0.5mo1／l NaCl溶液中，混匀，静置 15min后放入布氏漏斗抽滤，水洗滤饼至中 性。最后将滤饼悬浮于所选择的起始洗脱 缓冲液中。使用后的回收处理和上述步骤 相同，只是省略了将滤饼悬浮于1mo1／l HCl溶液这一步。
实验三
底物浓度对酶促反应速度的影 响（米氏常数的测定）
酯酶的分离、纯化与活性测定
实验原理
实验操作
实验器材、药品 注意事项
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原理
酯酶是A—酯酶，B—酯酶和胆碱酯酶的总称，它与人体有机磷药物中毒机 制有关。
本实验利用离子交换层析法分离和纯化酯酶，常用的阳离子交换剂有弱酸 性的羧甲基纤维素(CM—纤维素)，阴离子交换剂有弱碱性的二乙氨基乙基纤维 素(DEAE—纤维素).
生物化学实验指导课件
天水师范学院生物系
二OO二年二月
生物化学实验指导
前 言
随着生物化学的发展和生物化学教学内容的不断 丰富。生物化学实验也在不断更新和提高。1992 年，我们编写了一本《生物化学实验指导》作为 专科生实验教材，并在实验教学的过程中不断修 改并加以充实。这次编写的生物化学实验指导是 在以往工作的基础上，结合生物化学实验教学改 革、作为本、专科生物化学实验教改项目的一个 重要内容。 在这次编写过程中，我们确立了这样一个指导思 想⑴去掉了许多定性和验证性实验，加大了定量 分析的内容；⑵在同一项目实验中，同时介绍了 不止一种方法和技术⑶增加了部分大实验，力求 使学生有一个完整的实验训练过程，有利于培养 学生实验设计能力、分析问题能力和独立操作能 力，以达到知识、能力和素质的全面提高。
梯度洗脱法是在洗脱过程中，使洗脱液的pH或盐浓度(或两者同时)发生连 续的梯度变化，从而使吸附在柱上的各组分在不同的梯度下洗脱下来。本实验 采用的是盐离子浓度梯度洗脱法，其装置由两个彼此相连的容器组成，在与层 析柱相连接的一个容器(混合瓶)中，放入梯度洗脱开始时所需浓度的盐溶液 (低浓度)，并配有搅拌装置，另一容器(贮液瓶)中放入高浓度的盐溶液，其浓 度即梯度洗脱最后所需的浓度。两个容器的底部必须保持水平，液面的高度也 应该相同。这样，当两容器之间的通道打开，并使混合瓶溶液流进层析柱时， 梯度即开始形成。由于这两个容器是连通的，当混合瓶的溶液开始流入层析柱， 它的液面高度就逐渐下降，为了维持两容器的液面高度的一致，高浓度的盐溶 液即从导管流入混合瓶，结果混合瓶中溶液的盐浓度呈梯度上升。
蛋白质的混合物与纤维素离子交换剂的酸性基团或碱性基团相结合，结合 力的大小取决于彼此间相反电荷基团的静电引力，这又与溶液的pH有关，因为 pH决定离子交换剂和蛋白质的解离程度。盐类的存在可以降低离子交换剂的解 离基团与蛋白质的相反电荷基团之间的静电引力。因此，被吸附的蛋白质的洗 脱通过改变pH或离子强度(或二者同时改变)来实现；与离子交换剂结合力小的 蛋白质首先从层析柱中被洗脱下来。本实验采用CM—纤维素离子交换剂，通过 柱层析，经梯度洗脱从鼠肾丙酮粉抽提液中分离、纯化酯酶。
实验八
3，5—二硝基水杨酸比色定糖法 Fo1in—酚法测定血清蛋白质含量 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳 蛋白质分子量测定（葡聚糖凝胶薄 层层析法） 脂肪酸的β-氧化 核酸浓度测定—定磷法 血液中转氨酶活力的测定(分光光 度法) 维生素C的定量测定
高级实验
实验一 酯酶的分离、纯化与活性测定
实验二
酯酶同功酶的垂直板不连续聚 丙烯酰胺凝胶电泳分析
按100mg丙酮粉加入5m1 1×10—2mo1／l pH6.0磷酸 缓冲液的比例，将二者放入烧杯中，置于冰箱内抽提 30min，不时搅拌。抽提液在3000r／min下离心10min， 上清液即为粗酶制剂(保存于冰箱待用)。测定此粗酶制 剂的蛋白含量(按Fo1in—酚试剂法)和酶活性。
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二、CM—纤维素离子交换剂的处理
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三、层析柱的安装和平衡
洗净一支1.5×40cm的玻璃(管)柱(也可选用规格合适的商 品层析柱)， 准备两个橡皮塞，将其中一个的中央插入一根 玻璃细管，上面覆盖一圆形尼龙网片或一块绢布。玻璃细管 上连接一根细胶管，与部分收集器相连，将这个橡皮塞安入 层析柱的下端，另一橡皮塞中央也插人一根玻璃细管，并接 上一根胶管与洗脱液混合瓶下口相连。此橡皮塞塞入层析柱 的上端。两端胶管上各备一个螺旋夹。将层析柱架至垂直， 夹紧下端胶管，向层析柱内加入蒸馏水(约2／3柱高)，然后将 预处理好的离子交换纤维素装入柱内，使其自由沉降至柱的 底部，放松柱下端螺旋夹，让柱内液体慢慢流出。待树脂沉 降至所需高度(约30cm)后，置一圆形滤纸或尼龙片于胶面， 待胶面只剩下一薄层水时，夹紧下端夹子，向柱内加入数ml 洗脱起始缓冲液，松开下端夹子，用起始缓冲液渗洗平衡， 先是压力较小，后增至洗脱时的压力(平衡10h左右为宜)。若 平衡压力过大，柱内树脂被压迫太紧，影响流速。平衡好的 柱面应存留一薄层缓冲液，旋紧下端螺旋夹。
本实验指导共计十五个实验，分基础实验、 提高实验、高级实验三篇，内容覆盖了当今生物 化学研究中常用的方法与技术。
基础实验
实验一 蛋白质的沉淀、变性反应 实验二 蛋白质的等电点测定(pH法) 实验三 酶的特性 实验四 菜花(花椰菜)中核酸的分离
和鉴定
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提高实验
实验一 实验二 实验三 实验四
实验五 实验六 实验七
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操作
流程图
粗酶制剂制备 层析介质处理
层析柱安装 组合层析装置
上样 梯度洗脱 酯酶活性测定 结果处理
六 五 四 三 二一
CM—
结酯加层
粗
果酶样析
酶
处 理
活 性 的 测 定
和 梯 度 洗 脱
柱 的 安 装 和 平 衡
纤 维 素 离 子
制 剂 的 制 备
交
换
剂
的
处
理
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一、粗酶制剂的制备
杀死大白鼠，迅速剖腹取肾，置于冰浴中剔除脂肪 和结缔组织。新鲜肾组织和—15℃丙酮，按10g重量和 100m1容积的比例，一同置入Waring捣碎器中捣碎，为 避免温度升高，捣碎0.5min后，把匀浆倒入烧杯中，置 于冰盐浴冷至—15℃，再捣碎0.5min，反复3次。然后 把匀浆倾人布氏漏斗抽滤，用—15℃丙酮洗涤3次，按 上述方法再捣碎滤饼，抽滤和洗涤一次。将最后得到的 滤饼散置于表面皿，放入真空干燥器干燥数天，即得丙 酮粉干品，每10g新鲜肾组织可制得丙酮粉3—4g。