抗体库筛选技术介绍
抗体筛选理论及方法(杨君青)
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原理和意义
抗筛细胞的要求 试管法抗球蛋白试验 凝胶法抗球蛋白试验 聚凝胺试验 常见疑难问题
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内 套 管壁
反应 室 反 应 室 底 孔 外管壁 亲和凝 胶
特殊粘液
试剂或 盐水 凝胶或 玻璃珠
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凝胶技术的原理
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溶血性抗体：抗体在体外激活补体，导致溶血。 可用5%的EDTA按1:10比例加入血清中，螯合钙离子 ，抑制补体激活。 冷抗体：先离心，37℃孵育2-3分钟，在水浴箱中直 接看结果。 自身抗体：直抗试验。
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常用的质控方法： 1. 聚凝胺法：用阳性对照试剂与待检血清按同样步骤进 行质控试验，结果应为“1+”的弱凝集。
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如果红细胞表面结合了抗体/补体，加入抗球蛋白分子后，可 在这些抗体/补体之间“搭桥”，产生红细胞凝集现象。 自身免疫性溶血性贫血、输血反应、新生儿溶血病的诊断
/wikipedia/commons/1/1c/Coombs_test_schematic.
反应室下端底孔很小，液体在孵育过程中不会流入下方微 柱中。 离心时，反应室中的红细胞和血清混合液穿过反应室底孔 ，与微柱中液体汇合。由于该液体的比重在红细胞与血清 之间，血清比重低，因此不能在离心力的作用下继续向柱 底运动，红细胞的比重略重，能继续向下脱离血清穿过液 体层，直达凝胶上部。 在这一过程中，被IgG致敏的红细胞将与液体层中的抗球 蛋白试剂反应，形成凝集，因而无法穿过凝胶层达到柱底 ，红细胞滞留在凝胶层的顶部。 未被IgG致敏的红细胞不会形成凝集，在离心力作用下会 直达柱底。血清因停留在液体层的上部，不会中和液体层 中的抗球蛋白试剂。柱的形状也很重要，很细或呈扁平状 ，柱内液体不易受离心力作用旋转混合
抗体筛选技巧
抗体筛选技巧抗体筛选技巧1. 引言在现代生命科学研究中，抗体在许多实验和应用中发挥着重要的作用。
抗体的选择和筛选是获得高质量抗体的关键步骤。
本文将介绍几种常用的抗体筛选技巧，帮助研究人员更有效地选择适用的抗体。
2. 背景知识在开始抗体筛选之前，我们需要了解一些基本概念。
抗体是一种由免疫系统产生的蛋白质分子，可以识别和结合目标分子，如细菌、病毒、蛋白质等。
抗体筛选旨在从大量候选抗体中鉴定和选择具有高亲和力和特异性的抗体。
3. 抗体筛选技巧3.1 免疫吸附法免疫吸附法是一种常见的抗体筛选方法。
该方法利用已知抗原固定在固相载体上，然后与抗体混合反应，通过洗脱非特异性结合抗体，最终获得特异性的抗体。
这种方法适用于具有高亲和力和特异性的抗体的筛选，可以用于活体和死体标本。
3.2 免疫组化技术免疫组化技术结合了免疫学和组织学的原理，用于检测细胞和组织中特定分子的存在和分布。
该技术可以帮助研究人员验证抗体的特异性和亲和力，并确定其在特定细胞或组织中的表达情况。
在抗体筛选中，免疫组化技术可以用于确认候选抗体的特异性。
3.3 流式细胞术流式细胞术是一种高通量的细胞分析技术，可以同时检测和筛选大量细胞。
在抗体筛选中，流式细胞术可以用于确定抗体的亲和力、特异性和适用范围。
通过标记目标分子和抗体，可以利用流式细胞术定量地分析抗体与细胞及其表面分子的相互作用。
3.4 直接酶标记法直接酶标记法是一种高灵敏度的抗体筛选技术，可以快速鉴定和筛选高亲和力的抗体。
该技术利用酶标记的抗体与抗原结合后，通过酶活性产生的化学反应或发色反应来检测抗体-抗原复合物的存在。
该方法操作简单，灵敏度高，适用于大规模抗体筛选。
4. 讨论与总结抗体筛选技巧的选择应基于研究目的、样本类型和实验条件。
免疫吸附法和免疫组化技术适用于确定抗体的特异性和亲和力，可以对候选抗体进行初步的筛选。
流式细胞术可以进一步评估抗体在细胞水平上的特异性和亲和力，而直接酶标记法可用于快速大规模的抗体筛选。
噬菌体抗体库筛选技术研究进展 - 文章编号1007-8738(2005)S-0058
[ 1 ] W illats W G. Phage disp lay: p racticalities and p rospects [ J ]. P lant M ol B iol, 2002, 50 ( 6) : 837 - 854.
[ 2 ] Ladner RC. Phage disp lay and pharmacogenom ics [ J ]. Pharm acog2 enom ics, 2000, 1 ( 2) : 199 - 202.
收稿日期 : 2004 - 03 - 22; 修回日期 : 2004 - 05 - 08 基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (No. 30371399) 作者简介 : 薛国柱 (1966 - ) , 男 , 河南新野人 , 副主任医师 , 博士生.
Tel: ( 29) 83375259; Email: xgzh2003@ yahoo. com. cn
噬菌体 抗 体 库 的 筛 选 包 括 两 个 主 要 步 骤 : 淘 筛 和 鉴 定 [5 ] 。淘筛 (panning)是将噬菌体抗体库与选择用的抗原共 同孵育 , 通过几轮洗脱 , 收集结合的噬菌体 。将获得的噬菌 体感染细菌并扩增 , 再进行下一轮的淘筛 。经几轮淘筛后 , 便可富集到与抗原特异性结合的噬菌体感染的多克隆菌株 。 鉴定过程是从噬菌体感染的多克隆菌株中挑选出单克隆菌 株 。即将淘筛出的噬菌体感染细菌 、铺板 、挑选 , 即可得到 高特异性单克隆菌株 。
由于膜蛋白密度的差异及膜分子暴露程度的不同 , 对未 知抗原的分离鉴定有很大困难 , 因而在很长一段时间内抗体 库没有被用于对肿瘤特异性抗体的筛选 [11 ] 。最近 , 直接用肿 瘤细胞从单链噬菌体抗体库中筛选肿瘤特异性抗体已有报 道 。如 Kup sch等 [12 ]筛选出与黑色素瘤细胞特异性结合的抗 体 。R idgway等 [13 ]采用先将正常支气管上皮细胞系与非特异 性的噬菌体抗体清除后 , 再用肺腺癌细胞系进行筛选的方法 , 得到抗 CD55的单链抗体 。但即使这样 , 其筛选效率仍较低 , 而且容易丢失亲和性高的噬菌体 。 Siegel等报道了磁性细胞 分离法 (magnetically2activated cell sorting, MACS) 。即用抗原 阳性的细胞包裹磁珠 , 然后与大量抗原阴性的细胞混合 , 加 入待筛选的噬菌体作用后 , 再通过磁柱快速分离结合特异性 噬菌体的抗原阳性细胞 。他们采用 MACS法 , 以人血红细胞 Rh (D ) +细胞为靶细胞 , Rh (D ) - 细胞吸收非特异性噬菌体 , 成功地从 Fab噬菌体抗体库中筛选出一系列抗 Rh (D)的抗体。
从大容量噬菌体抗体库中筛选抗体
将所分析得到的抗原性高的基因序列进行 ＢＬＡＳＴ比 对。选取抗原性高且与其他蛋白没有同源性的蛋白片 段进行表达。 １．２．２ 细胞培养 ＨｅＬａ细胞以 １×１０５接种于含 １０％ 胎牛血清的 ＤＭＥＭ 培养液中，５％ＣＯ２／９５％空气，３７℃ 孵育培养。 １．２．３ 总 ＲＮＡ提取及 ＲＴ?ＰＣＲ 收集指数生长期细 胞，Ｔｒｉｚｏｌ提取总 ＲＮＡ。定量后，Ｍ?ＭＬＶ逆转录酶合成 ｃＤＮＡ第一链。以反转录获得的 ｃＤＮＡ为模板，分别用 两对引物 Ｐ１，Ｐ２和 Ｐ３，Ｐ４对目的基因片段进行 ＰＣＲ扩 增。扩增反应的条件均为：９５℃预变性 １０ｍｉｎ，９４℃变 性 ４５ｓ，５５℃退火 ３０ｓ，７２℃延伸 １ｍｉｎ，扩增 ３０个循环。 ＰＣＲ扩增产物经 １％琼脂糖凝胶电泳回收纯化。 １．２．４ 重组克隆载体 ｐＧＥＭ?ＴＤＰＫ３和 ｐＧＥＭ?ＴＤＰＫ４ 的构建与鉴定 将纯化的两段 ＰＣＲ产物分别连入载体 ｐＧＥＭ?ＴＥａｓｙ，构建重组质粒 ｐＧＥＭ?ＴＤＰＫ３和 ｐＧＥＭ?Ｔ ＤＰＫ４，转化感受态 Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α后 挑 取 阳 性 克 隆，用 ＮｄｅⅠ ／ＸｈｏⅠ 双 酶 切 质 粒 ｐＧＥＭ?ＴＤＰＫ３和 ｐＧＥＭ?Ｔ ＤＰＫ４，将两段目的基因片段分别回收纯化。 １．２．５ 重组表达载体 ｐＥＴ２２ｂ?ＤＰＫ３和 ｐＥＴ２２ｂ?ＤＰＫ４ 的构建与诱导表达 将纯化的两段目的基因与经 Ｎｄｅ Ⅰ ／ＸｈｏⅠ双酶切的载体 ｐＥＴ?２２ｂ（ ＋ ）相连接，分别 构建重组表达载体 ｐＥＴ２２ｂ?ＤＰＫ３和 ｐＥＴ２２ｂ?ＤＰＫ４，转 化感受态 Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α后挑取阳性克隆，用 ＮｄｅⅠ ／Ｘｈｏ Ⅰ双酶切鉴定。经测序分析正确的重组质粒 ｐＥＴ２２ｂ? ＤＰＫ３和 ｐＥＴ２２ｂ?ＤＰＫ４ 转 化 感 受 态 Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１ （ＤＥ３），挑取阳性克隆，接种于 １０ｍｌＬＢ／Ａｍｐ＋培养基 中，于 ３７℃培 养 过 夜。按 １％ 比 例 将 工 程 菌 转 接 于 ５００ｍｌ新鲜的 ＬＢ／Ａｍｐ＋培养基中，３７℃培养至 ＯＤ６００约 ０．５时，加 入 终 浓 度 为 ０．８ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ诱 导 表，于 ３７℃培养 ３ｈ。表达产物用 ＳＤＳ?ＰＡＧＥ检测。取 ５０ｍｌ 经诱导表达 的 工 程 菌 超 声 裂 解 后，分 别 取 上 清 组 分 及 沉淀组分 ＳＤＳ?ＰＡＧＥ分析。 １．２．６ 融合蛋白 ＤＰＫ３和 ＤＰＫ４的纯化 收获的工程 菌经超声破菌后，将沉淀物用 １％ ＴｒｉｔｏｎＸ?１００漂洗后 用缓冲液 Ａ（２ｍｏｌ／Ｌ尿素，２０ｍｍｏｌ／ＬＰＢＳ，ｐＨ７．５）于 ４℃洗涤 ２ｈ，离心收集沉淀。经粗提的包涵体溶解于 缓 冲 液 Ｂ（８ｍｏｌ／Ｌ 尿 素，２０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳ ｐＨ８．０， ０．５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ，２０ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑），４℃搅拌 ２ｈ，使其充 分溶解。离心后取上清以 １ｍｌ／ｍｉｎ的流速上样于经缓 冲液 Ｂ平衡后的 ＨｉｓＴｒａｐＨＰ亲和柱，上样后以缓冲液 Ｂ洗 柱；而 后 通 过 梯 度 混 合 器 形 成 从 缓 冲 液 Ｂ到 Ｃ
生物制药技术中的单克隆抗体制备方法解析
生物制药技术中的单克隆抗体制备方法解析单克隆抗体（Monoclonal Antibodies，mAbs）是一种重要的生物制药产品，被广泛应用于医学诊断、治疗和研究领域。
其制备方法主要包括杂交瘤技术、单克隆抗体库筛选和重组DNA技术。
本文将详细解析生物制药技术中的单克隆抗体制备方法。
杂交瘤技术是单克隆抗体制备的关键步骤之一。
这种方法的基本原理是通过将一个特定种类的癌症细胞（例如骨髓瘤细胞）与特异性抗原刺激的B细胞融合，形成能够持续产生抗体的杂交瘤细胞。
具体步骤如下：首先，选择一个特定的抗原，并注射到实验动物体内，以刺激其免疫系统产生抗体。
然后，从这只实验动物中提取脾脏或骨髓细胞，这些细胞中富含产生抗体的淋巴细胞。
接下来，将这些淋巴细胞与骨髓瘤细胞（例如骨髓瘤细胞NS-1）融合。
融合细胞称为杂交瘤细胞（Hybridoma）。
由于骨髓瘤细胞本身是无能力产生抗体的，所以融合后的杂交瘤细胞将继承B细胞的抗原识别特异性。
为了筛选出单克隆抗体，需要对杂交瘤细胞进行筛选和克隆化。
通常使用有限稀释法（Limiting Dilution）将杂交瘤细胞稀释至单个细胞水平进行培养。
以此保证每个杂交瘤细胞来自于单个淋巴细胞，形成单一克隆群落。
随后，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）或流式细胞术等方法，对每个克隆群进行抗体筛选，以确定抗原特异性的单克隆抗体。
对于流式细胞术，可以利用荧光标记的抗体检测该抗体对特定抗原的结合能力。
一旦筛选出单克隆抗体，需要将其进行扩增和纯化。
通常，单克隆抗体可以通过培养杂交瘤细胞并收集培养液中的抗体来扩增。
然而，杂交瘤细胞存在一定的维持成本和困难，需要长期保存。
因此，采用重组DNA技术来制备单克隆抗体的方法更为常见。
重组DNA技术是通过将单克隆抗体的V（可变）和C（恒定）区域的DNA序列克隆和表达在细胞中。
这种方法的优点是可以避免使用动物，同时也可以修改抗体的结构以增强其效能。
具体步骤如下：首先，需要提取单克隆抗体的V和C区域的mRNA。
抗体库技术
5.2.2.2 抗体库筛选技术
•1. 用于筛选的抗原 • 能够将结合与非结合形式的噬菌体分离开
的方法均可用于筛选 • a 可溶性抗原包被于酶标板（聚苯乙烯） • b 将抗原固定化到琼脂糖微珠上，亲和柱
层析
• C 生物素-抗原+ 抗体库→
• 基因工程抗体，极大地改善了抗体的性能 和扩展了抗体的应用范围
• 抗体库技术，通过DNA重组技术，克隆全 套抗体可变区基因，在原核系统表达有功 能的抗体分子片段（即抗体库），从中筛 选特异性抗体的基因。
• 两项关键技术：
• PCR：用一组引物，扩增出全套免疫球蛋 白的可变区基因
• 以大肠杆菌(或噬菌体)直接表达有功能活性 的抗体分子片段
• 噬粒做表达载体，来源于辅助病毒的野生 型蛋白Ⅷ和蛋白Ⅷ-抗体融合蛋白共同组装 到噬菌体表面，各自的表达数目取决于两 者的相对数量
• 每一个噬菌体表面可表达24个左右的抗体 分子
• 基因Ⅲ(蛋白Ⅲ )：
• 用噬菌体载体产生多价抗体分子
• 用噬粒表达，所产生的噬菌体抗体颗粒中 10%表达有抗体分子片段，单价
• 辅助噬菌体是一类自身DNA复制效率极低 的突变型，但可为宿主细胞的质粒DNA提 供复制和包装所需的蛋白酶和外壳蛋白
• 用辅助病毒超感染，辅助病毒提供所有的 丝状噬菌体蛋白，将噬粒DNA 以单链的形 式包装在噬菌体外壳蛋白内，形成病毒颗
粒，可以感染大肠杆菌，但不产生（辅助 噬菌体）子代噬菌体。
• 噬粒载体中插入抗体分子片段与基因Ⅲ或 基因Ⅷ
• 基因工程抗体技术，是继杂交瘤单克隆抗 体技术以后抗体领域的又一次革命
• "噬菌体抗体库技术"又被誉为这次革命中 的革命
噬菌体抗体库技术
非免疫抗体库包括天然抗体库、半合成抗体库和全合成抗体库。
天然抗体库是采用不经过免疫的淋巴细胞构建的抗体库,半合成抗体库是人工合成一部分可变区序列与另一部分天然序列组合构建的抗体库,而全合成抗体库是指抗体可变区序列全部由人工合成。非免疫抗体库的优点是抗体均来源于人类,是完全的人源化抗体,但亲和力通常较低,除非生成大量的抗体片段。
噬菌体抗体库技术
答辩学生：XXX 指导老师：XXX
噬菌体抗体库技术概述
噬菌体展示系统
噬菌体抗体技术的操作
噬菌体抗体库技术原理
噬菌体抗体库的分类
噬菌体抗体库技术的发展关键
丝状噬菌体生物学
噬菌体展示所使用的衣壳蛋白
噬菌粒与辅助噬菌体
多价展示与单价展示
抗体可变区基因的获得
噬菌体抗体库载体的构建
噬菌体抗体库的筛选
2.噬菌体展示系统
2.1 丝状噬菌体生物学
01
DNA在细菌内滚环复制，细菌不被裂解，但生长速度减慢，并且分泌大量噬菌体颗粒
丝状噬菌体：M13、f1和fd。
单链DNA病毒,6407bp。
基因组编码11种蛋白质，其中5种为结构蛋白质。与展示密切相关的有两种结构蛋白质。
02
03
04
2.1 丝状噬菌体生物学
（3）体内筛选
体内筛选适用于无法分离培养用于筛选的细胞,或抗体与体内细胞间的相互作用过于复杂无法在体外实现的情况。使用体内筛选时将噬菌体抗体库注射入动物机体,回收动物器官分离抗体,再经过多轮的筛选,扩增,纯化得到目的抗体。但由于该方法涉及体内的多种生物学过程,影响因素多且无法预测,成功率低,还有待于进一步的发展。
03
构建一个噬菌体抗体库,首先必须克隆出B细胞内抗体的全套可变区基因。考虑到高亲和力抗体筛选所需要的步骤和抗体的多样性,选用淋巴结细胞建库是比较好的。
抗体库筛选技术介绍
抗体库筛选技术介绍导读自从噬菌体展示技术于1985年创立以来,细胞生物学、免疫学、蛋白质工程以及医药行业等领域深受影响。
它从根本上了改变了传统的单抗制备流程(杂交瘤技间接术)，宣告在体外改良抗体的特异性以及进行亲和力成熟。
随着该技术的不断发展,继而出现了核糖体展示、mRNA展示、细菌展示和酵母展示等多种展示技术.这篇文章主要以噬菌体展示抗体库为例，来介绍抗体库的筛选技术。
抗体库的筛选是指从抗体库中筛选出针对某一抗原的特异性抗体，是获得高亲和力抗体过程中的关键环节。
那什么是抗体库呢？通过PCR和DNA重组技术克隆人类或者动物体内全套抗体可变区基因（关于抗体的具体结构详见抗体的基本结构），并通过展示技术进行表达，得到的全套抗体基因表达文库即为抗体库.图1、抗体库克隆的抗体基因片段（SCFV）图2、噬菌体展示抗体库构建流程由于单抗性质的千差万别，抗体库的筛选需要根据不同的单抗制定严格的筛选条件，优化筛选方法，因此抗体库的筛选技术一直处于发展和改进的状态,根据出现时间的先后,主要分为经典筛选法和新型筛选法。
1、经典筛选法经典筛选法主要包括固相筛选法和液相筛选法，适合针对性质明确并且可纯化的抗原进行抗体筛选。
固相筛选法是通过包被在酶标板或者免疫试管等固相介质上的抗原富集高亲和性的噬菌体；液相筛选法是将生物素化的抗原包被在与亲和素偶联的磁珠或琼脂糖上，通过磁珠富集能与抗原特异性结合的噬菌体抗体，再通过洗涤、洗脱、回收等步骤。
如此反复筛选数次,可得到高亲和性的噬菌体.这两种方法可通过添加脱脂牛奶或者BSA来减少非特异性结合.2、新型筛选法对于抗原无法提纯或者性质不明确的情况（如癌细胞表面受体），或者经典筛选过程可能造成抗原失活的情况,需要开发新的筛选方法。
目前的新型筛选法主要有细胞筛选法、组织切片或体内筛选法、选择感染筛选法和蛋白质芯片筛选法等。
细胞筛选法:细胞筛选能维持抗原和抗体的天然构象，因此在对肿瘤细胞筛选方面应用较多，该技术还适合于细胞表面受体筛选和抗原鉴定等。
抗体库筛选技术介绍
抗体库筛选技术介绍
1.抗体库构建：首先，需要构建一个包含大量不同抗体的抗体库。
常见的方法包括免疫化学方法、获得单个免疫球蛋白B细胞并进行单细胞PCR扩增、切割免疫球蛋白链并进行克隆等。
2.抗原或目标蛋白筛选：抗体库中的抗体会与抗原或目标蛋白发生特异性结合。
通常使用抗原或目标蛋白对抗体库进行筛选。
抗原或目标蛋白可以是合成的多肽、重组蛋白、整个细胞或其组分等。
3.高亲和力筛选：在已经进行了初步筛选的抗体库中，利用高亲和力进行筛选。
这可以通过几个方法实现，如亲和柱层析、溶液竞争结合、表面等的相互作用等。
目的是筛选出具有高亲和力的抗体。
4.特异性筛选：特异性是指抗体只与特定抗原结合，并且不与其他物质发生结合。
特异性筛选通常可以通过ELISA、胶体金或荧光标记等方法来进行。
通过多次筛选，以获取高特异性的抗体。
5.功能性和应用评估：在筛选过程结束后，需要对获得的抗体进行进一步的功能性和应用评估。
常见的评估方法包括免疫组织化学、流式细胞术、免疫印迹、细胞免疫活化等。
总之，抗体库筛选技术是一种快速有效的抗体筛选方法，可以获得高质量的抗体，为研究和医学进展提供了重要的工具。
抗体筛选方法
抗体筛选方法抗体筛选方法抗体是一种能够识别并结合特定分子的蛋白质，具有广泛的应用价值。
在生物医学研究和临床诊断中，抗体被广泛应用于检测、治疗和预防疾病。
然而，抗体的制备和筛选是一个复杂的过程，需要选择合适的方法和技术。
本文将介绍几种常用的抗体筛选方法。
1. 酶联免疫吸附法（ELISA）ELISA是一种常用的抗体筛选方法，其原理是利用抗体与特定抗原结合的特异性来检测抗体的存在。
在ELISA中，将抗原固定在微孔板上，加入待测抗体，经过洗涤后，加入与待测抗体结合的二抗，再加入酶标记的底物，通过测定底物的反应产物的光学密度来判断抗体的存在。
ELISA具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，适用于大规模筛选抗体。
2. 流式细胞术（FACS）FACS是一种利用流式细胞仪对细胞进行分析和筛选的方法。
在抗体筛选中，将抗原标记在细胞表面，加入待测抗体，经过洗涤后，加入荧光标记的二抗，通过流式细胞仪对细胞进行检测和分析，筛选出与抗原结合的抗体。
FACS具有高通量、高灵敏度、高特异性等优点，适用于筛选高亲和力的单克隆抗体。
3. 质粒显示技术（Phage Display）质粒显示技术是一种利用噬菌体表面展示抗体库的方法。
在质粒显示技术中，将抗体基因插入噬菌体基因组中，使噬菌体表面展示抗体库，加入待测抗原，经过洗涤后，筛选出与抗原结合的抗体。
质粒显示技术具有高通量、高特异性、高亲和力等优点，适用于筛选高亲和力的单克隆抗体。
4. 蛋白芯片技术（Protein Microarray）蛋白芯片技术是一种利用微阵列技术展示蛋白质的方法。
在蛋白芯片技术中，将抗原固定在芯片上，加入待测抗体，经过洗涤后，加入荧光标记的二抗，通过检测荧光信号来筛选出与抗原结合的抗体。
蛋白芯片技术具有高通量、高特异性、高灵敏度等优点，适用于筛选多种抗体。
综上所述，抗体筛选方法多种多样，每种方法都有其优缺点。
在选择抗体筛选方法时，需要根据实验的具体要求和条件进行选择。
光导抗体筛选
光导抗体筛选
光导抗体筛选是一种将生物传感器技术应用于抗体筛选的方法。
该方法利用特定波长的光激发荧光基团或电化学活性基团，这些基团可标记抗体或抗原，随后被光电检测器检测到。
以下是光导抗体筛选的基本步骤：
1.将荧光标记物或电化学活性物质结合到抗体上，形成标记抗体。
2.将标记抗体与待筛选的抗体混合，并加入抗原，形成抗原-抗体-标记抗体的复合物。
3.通过特异性抗体与抗原的相互作用，结合在抗原上的标记抗体和未结合的标记抗体被分离。
4.用激发光照射已结合的标记抗体，引起荧光或电化学反应，产生的信号被光电检测器检测和记录。
5.通过比较信号的强度，确定待筛选抗体的亲和力和特异性。
光导抗体筛选具有高通量、高灵敏度和自动化操作等优点，可广泛应用于生物药物筛选、临床诊断和免疫分析等领域。
Rh抗原Fab抗体库的构建与筛选
Rh抗原Fab抗体库的构建与筛选作者：陈琦, 张嘉敏, 张海燕, 朱自严, 李厚达【摘要】目的: 构建抗体库并筛选Rh抗原的Fab抗体。
方法: 收集5份血清中抗Rh抗体效价在1∶256～512的人淋巴细胞, 提取RNA, 用多对引物PCR扩增VH、 Vκ、 Vλ基因, 并分别从pComb3xTT和pComb3xλ噬粒中扩增CH1、 Cκ、 Cλ, 通过重叠PCR, 构建重链Fd 基因及完整的kappa、 Lamda轻链, 并进一步重叠PCR, 获得Fab抗体片段。
Fab经酶切、连接并电转化到噬菌体抗体表达载体pComb3xSS 中, 构建获得抗Rh的Fab抗体库, 经4轮Rh(-)/ Rh(+)红细胞阴/阳淘筛, 获得的阳性克隆分别进行血凝试验、 Western blot分析及测序鉴定。
结果: 构建获得总库容为7.4×106的Fab抗体库, 并从中筛选得到1株能特异结合Rh抗原的Fab抗体。
结论: 应用基因工程抗体技术, 成功获得了1株能与Rh(+)红细胞特异凝集的Fab抗体, 为制备能用于临床的特异性强、效价高, 并具有自主知识产权的Rh抗体打下基础。
【关键词】 Rh血型; 基因工程抗体; 噬菌体抗体库; Fab [Abstract] AIM: To Construct Fab antibody against Rh antigen. METHODS: The variable regions of light and heavy chains were amplified by RT PCR from the PBMCs of volunteers with high titer (1∶256512 by inditect agglutation) antibody to Rh antigen. Meanwhile, the genes of constant regions of light and heavy chains were isolated from pComb3xTT and pComb3xλ phagmidcarrying the templates respectively. Vκ light chain and Fd heavy chain were linked by the first splicing overlapping extension PCR (SOE), and a full length Fab gene was created by the second SOE. The Fab gene was ligated to phagmid pComb3HxSS and transformed to E.coli XL1Blue by electroporation. The obtained human Fab phage antibody library was panned using Rh(-)/Rh(+) RBC four times. the phage antibodies against Rh antigen were highly enriched. Indirect agglutation test, western blot analysis and sequencing analysis were performed to detect the specificity of Fab against Rh. RESULTS: The repertoire of human phage display Fab library was 7.4×106. After panning, A Fab clone which could bind to Rh antigen specifically was obtained. CONCLUSION: A Fab antibody that specifically aggulated Rh(+) RBC is obtained, this makes it possible to produce Rh antibody with high quantity and effection in our country.[Keywords]Rh antibody; genetic engineering antibody; phage display antibody library; FabRh血型是人类29个血型系统中最复杂、最富有多态性的一种, 该血型根据红细胞表面是否有Rh抗原分为Rh(+)和Rh(-)两种。
抗体筛选试验操作步骤
ORTHO BioVue
抗体筛选试验操作步骤
d卡一张，平衡至室温；
1、预先取出BioVue抗-IgG卡或抗-IgG，-C
3
将标有条形码的一边面向实验者，标记样本编号；（一卡2人）
2、撕开三孔的锡条（每一个试验），分别滴入50ul BLiss液。
3、用10ul加样枪分别取10ul BioVue筛选红细胞1# /2# /3# 依次加
入三孔中。
4、用40ul加样枪分别取40ul 病人血清依次加入此三孔中。
5、孵育10分钟。
6、离心5分钟，判读结果。
备注：
1、往卡上的反应腔中加样时，注意加样枪应保持45°角，沿管侧壁加入，并
保留空气间隔，切不可垂直加入或用力过猛。
2、严格遵循“先加红细胞，后加血清”的原则。
抗体库技术
一、选择性感染噬菌体展示 SIP技术的原理 294页
gIII蛋白
N1结构域 N2结构域 CT结构域
将筛选配体与N1、N2复合物化学偶联作为接头，与gIII融合蛋白特异 性结合，重组噬菌体恢复感染大肠杆菌的能力
a体内SIP
第三节 选择性感染噬菌体 展示抗体库技术
选择性感染噬菌体展示(selectively infective phage display)技术即SIP技 术,是在噬菌体展示技术的基础上发展起 来的。该技术通过将候选蛋白与配体之 间的结合反应与噬菌体感染和扩增直接 联系起来,不必经过亲和筛选与洗脱,直 接获得特异性候选蛋白基因。
用固相化抗原经“亲和结合一洗脱一扩增”数个循环直接、 方便、简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗 体噬菌体库。 筛选到的噬菌体再将基因g3或g8切除后，转入大肠杆菌， 使翻译出的抗体分泌到细菌的质周腔内，形成游离的抗体 片段，经过纯化即可获得目的抗体。
首先提取细胞的总RNA ,经过RTPCR 扩增可变区基因
四、噬菌体抗体库的应用
研制疫苗和诊断试剂 有学者用乙肝病人的 阳性血清中的抗体从噬菌体随机肽库中分离 到乙肝病毒特异性的噬菌体模拟肽；Lundin 等对HIV-1 病毒也做了相应的研究,从噬菌体 抗体库中分离到能够诱发针对HIV-1 的免疫 反应的噬菌体肽。
表位研究 确定核酸结合蛋白 通过构建锌指的随 机肽库,采用核酸作为靶分子进行筛选,可 以得到其相应的结合蛋白。 药物开发 利用噬菌体肽库的多样性,筛 选出能同受体特异结合的重组噬菌体多 肽，可作为受体的激动剂或拮抗剂。
英国剑桥的Ward等最早尝试了抗体库的构建， 他们用PCR从溶菌酶免疫后的小鼠脾细胞DNA扩 增出VH基因,测序证实了其多样性,在大肠杆菌 表达出VH段(单区抗体),检测2000个克隆得到 21个可以与溶菌酶特异结合的克隆。 这一工作未构建完整的抗原结合部位(无轻链), 也未提出有效的筛选方法,但它表明了抗体库 技术的可行性。
抗体筛选技术
抗体筛选技术
抗体筛选技术是一种用于寻找具有特定结合能力的抗体分子的方法。
这些技术可以用于从一个大的抗体库中鉴定出与目标分子高亲和力结合的抗体，并在药物研发、疾病诊断和治疗等领域发挥重要作用。
常用的抗体筛选技术包括：
1. 杂交瘤筛选：将免疫细胞与肿瘤细胞融合产生杂交瘤细胞，然后通过筛选方法选择出具有特定结合能力的杂交瘤细胞。
2. 单细胞技术：利用单细胞分离和扩增方法，将单个B细胞
分离并扩增，然后进行筛选。
3. 羊抗人技术：将目标抗原注射给动物，然后提取动物的抗体，通过与人类抗体结合的方式筛选出具有特异性的抗体。
4. 购买与筛选：从商业抗体库中购买抗体，然后通过实验验证筛选出具有特定结合能力的抗体分子。
5. Phage display技术：利用噬菌体表面展示抗体库，通过与目
标分子结合筛选出具有高亲和力的抗体。
6. 重组抗体技术：通过基因工程技术构建出具有特定结合能力的重组抗体，然后进行筛选。
这些筛选技术的发展使得科学家能够更高效地寻找和筛选出具有特定结合能力的抗体分子，推动了抗体研究和应用的发展。
亲和层析法用于噬菌体抗体库的筛选
亲和层析法用于噬菌体抗体库的筛选陈瑛炜,罗文新,王明桥,王晋,李利峰,袁权,张军,夏宁邵(福建省医学分子病毒学研究中心,厦门大学细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室,厦门 361005)摘要:本研究报道一种基于固定化金属亲和层析(IMAC )的噬菌体抗体库液相筛选方法。
将纯化的带有His 标签的抗原与噬菌体抗体库混合,噬菌体抗体与抗原充分结合后再加入亲和介质,使噬菌体抗体抗原复合物通过His 标签与介质结合,然后通过充分洗涤去除非特异性噬菌体抗体,最后将特异性噬菌体抗体洗脱下来,感染TG 1,进行下一轮筛选。
整个筛选过程中抗原与抗体的结合在液相中完成,不仅消除了固相介质对抗原表位的影响,也更有利于噬菌体抗体与抗原的充分作用。
将此方法应用于HEV N E2蛋白特异性人源噬菌体抗体的筛选,抗原竞争EL ISA ,阳性血清阻断,可溶性单链抗体表达检测及测序结果表明,最终获得2个特异性人源抗体。
关键词:噬菌体抗体库;固定化金属亲和层析;液相筛选中图分类号:R373;Q78 文献标识码:A 文章编号:1000-8721(2006)01-0044-06收稿日期:2005-04-27;修回日期:2005-07-12基金项目:福建省科技重大项目(编号:2002F013);国家十五创新药物博士基金(编号:2003AA2Z3539);福建省自然科学基金(编号:C0310005);厦门市科技计划项目(编号:3502Z20055002)。
作者简介:陈瑛炜(1982-),女,硕士,从事基因工程抗体研究。
通讯作者:罗文新,副教授,Tel 186259222184113;Fax :86259222181258;E 2mail :wxluo @jingxian 1xmu 1edu 1cn 噬菌体抗体库技术已经成为目前获得人源抗体的主要途径之一。
从大容量天然人源噬菌体抗体库中,理论上可以获得针对任何抗原的人源单抗。
噬菌体抗体库筛选方法包括纯抗原筛选,非纯抗原筛选,功能性筛选,选择性感染筛选等[1]。
抗体筛选和鉴定操作规程
抗体筛选和鉴定操作规程(一) 抗体筛选1. 抗体筛选的目的血型抗体是体内免疫系统所产生的针对血型抗原发生特异性反应的一类免疫球蛋白类物质。
人体血清内存在的抗体有5种类型：IgG.、 IgM、IgA.、IgD和IgE，其中IgG 和IgM是最重要的2种抗体。
红细胞血型抗体可以分为：①完全抗体：这些抗体能够在盐水介质中凝集相应的红细胞，所以又称为盐水抗体，它们主要是分子量较大的IgM；②不完全抗体：这类抗体主要是分子量较小的IgG，虽然能够结合红细胞上的抗原，但在盐水介质中不能使红细胞凝集。
有临床意义的血型抗体会导致溶血性输血反应，破坏输入的不配合的红细胞或缩短其寿命，产生溶血性输血反应，轻则影响治疗效果，重则危及患者生命；此外，对孕妇而言，抗体会引起新生儿溶血病，影响新生儿脏器的发育，并使其智力发育受到伤害，严重者则会危及新生儿的生命安全。
因此，抗体筛检是很必要而且必需的。
抗体筛检试验(antibody screening tests)主要筛查与红细胞反应的血型同种抗体。
对受血者的血清和血浆应进行常规的抗体筛选试验，以发现有临床意义的不规则的血型同种抗体。
所谓不规则抗体是指抗A和抗B以外的血型抗体。
抗体筛选试验的原则是让受检者的血清与筛选红细胞反应，以发现在37℃有活性的抗体。
患者接受输血、妇女妊娠都会刺激机体产生抗体。
抗体筛检试验能有效保证临床输血安全，避免新生儿溶血症的发生。
2. 抗体筛选的方法抗体筛选试验可在交叉配血试验之前进行或一起进行，这样有利于对患者抗体的早期确认及鉴定临床上有意义的抗体，避免一些可能的异常情况而造成病情的延误。
抗体筛选和鉴定使用的方法有盐水法、白蛋白介质法、低离子强度介质法(Liss)、聚凝胺法(polybrene)、凝胶法、酶技术、抗球蛋白试验等，可按抗体的血清学行为和试验的具体条件选择，但必须进行抗球蛋白试验。
抗体筛选试验不一定能检出所有有临床意义的抗体，一些抗低频率抗原的抗体或有剂量效应的抗体可能被漏检，这时需安排抗原更完全和特异性更强的筛选细胞进行试验，或用敏感度更高的技术进行检查。
抗体库技术_图文
• 4.抗体库技术得到的抗体可以在大肠杆菌表达,可利用 原核表达系统的优势。
• 5.一些难于制备的抗体,如针对弱免疫原、毒性抗原的 抗体,以及人源抗体的制备可以得到解决。
• 组合抗体库技术出现后不到一年, 即被噬 菌体抗体库技术所代替, 该技术是在噬菌 体表面展示(phage display)技术基础上 建立起来的, 是迄今为止发展最成熟、应 用最为广泛的抗体库技术。
抗体库技术_图文.ppt
丹麦
Niels K. Jerne
Georges J.F. Köhler
César Milstein
多克隆抗体的制备
B
A
C
Antigen
D
a
b
c
d
Antibodibody c
C
Antibody d
单克隆抗体的制备
基因工程抗体技术
• 20世纪80年代, DNA重组技术发展使制 备部分或全部人源化的基因工程抗体成 为可能，因此产生了基因工程抗体技术 。
（二）适应于大规模工业化生产
• DNA 操作是在细菌中增殖,比杂交瘤技术 简单快速,制备单抗从取脾细胞到稳定的 克隆株至少需要数月,而噬菌体抗体库技 术最短只需几周的时间。
（三）可获得不同亲和力的抗体
• 在构建噬菌体抗体库时,抗体重链与轻链 基因的重组,就模拟了机体内抗体亲和力 的成熟过程。在噬菌体抗体库中,抗体重 链与轻链间的配对存在着很大的随意性, 这往往能改变B 细胞中原有的抗体重、 轻链间的配对方式,产生出不同亲和力的 抗体。
• 药物开发 利用噬菌体肽库的多样性,筛 选出能同受体特异结合的重组噬菌体多 肽，可作为受体的激动剂或拮抗剂。
抗体库技术名词解释
抗体库技术名词解释抗体库技术是一种用于大规模收集、存储和筛选生物分子的技术,常用于医学研究、生物学研究和药物开发等领域。
以下是与该标题相关的正文:1. 抗体库(抗体文库):一种用于储存和标记抗体的大规模生物分子库。
抗体是一种蛋白质分子,可以与目标分子结合并发挥生物学作用。
抗体库技术可以通过使用抗体的特异性、灵敏度和稳定性来提高筛选效率和准确性。
抗体库中抗体的存储和标记通常涉及将抗体与特定的标记分子结合,以便在筛选过程中识别和标记目标分子。
2. 抗体纯化:一种将抗体转化为单个分子的过程,通常涉及去除其他生物分子和杂质,以确保抗体的纯度和特异性。
抗体纯化可以应用于制备新的抗体、开发新的药物以及改进现有的抗体药物。
3. 抗体库筛选:一种用于筛选抗体库中的生物分子的方法。
该方法通常涉及将目标分子与抗体结合,然后利用抗体的特异性和灵敏度来识别和标记目标分子。
通过使用不同的筛选条件,例如温度、pH值、反应时间等,可以筛选到大量的具有特定功能的抗体。
4. 抗体库优化:一种用于改进抗体库技术的方法。
该方法涉及优化抗体库的存储、标记和筛选过程,以提高抗体的灵敏度、特异性和筛选效率。
通过改进抗体库的构建过程和存储条件,可以提高抗体库的质量和产量,从而为医学研究和药物开发提供更多资源。
5. 抗体库应用:抗体库技术已被广泛应用于医学研究、生物学研究和药物开发等领域。
例如,抗体库技术可以用于开发新型抗体药物,以提高现有药物的疗效和减少副作用。
还可以用于诊断疾病、治疗病毒感染和肿瘤等疾病。
随着抗体库技术的不断发展,它将在未来成为更多研究和应用的重要工具。
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抗体库筛选技术介绍
导读
自从噬菌体展示技术于1985年创立以来，细胞生物学、免疫学、蛋白质工程以及医药行业等领域深受影响。
它从根本上了改变了传统的单抗制备流程（杂交瘤技间接术），宣告在体外改良抗体的特异性以及进行亲和力成熟。
随着该技术的不断发展，继而出现了核糖体展示、mRNA展示、细菌展示和酵母展示等多种展示技术。
这篇文章主要以噬菌体展示抗体库为例，来介绍抗体库的筛选技术。
抗体库的筛选是指从抗体库中筛选出针对某一抗原的特异性抗体，是获得高亲和力抗体过程中的关键环节。
那什么是抗体库呢？通过PCR和DNA重组技术克隆人类或者动物体内全套抗体可变区基因（关于抗体的具体结构详见抗体的基本结构），并通过展示技术进行表达，得到的全套抗体基因表达文库即为抗体库。
图1、抗体库克隆的抗体基因片段（SCFV）
图2、噬菌体展示抗体库构建流程
由于单抗性质的千差万别，抗体库的筛选需要根据不同的单抗制定严格的筛选条件，优化筛选方法，因此抗体库的筛选技术一直处于发展和改进的状态，根据出现时间的先后，主要分为经典筛选法和新型筛选法。
1、经典筛选法
经典筛选法主要包括固相筛选法和液相筛选法，适合针对性质明确并且可纯化的抗原进行抗体筛选。
固相筛选法是通过包被在酶标板或者免疫试管等固相介质上的抗原富集高亲和性的噬菌体；液相筛选法是将生物素化的抗原包被在与亲和素偶联的磁珠或琼脂糖上，通过磁珠富集能与抗原特异性结合的噬菌体抗体，再通过洗涤、洗脱、回收等步骤。
如此反复筛选数次，可得到高亲和性的噬菌体。
这两种方法可通过添加脱脂牛奶或者BSA来减少非特异性结合。
2、新型筛选法
对于抗原无法提纯或者性质不明确的情况（如癌细胞表面受体），或者经典筛选过程可能造成抗原失活的情况，需要开发新的筛选方法。
目前的新型筛选法主要有细胞筛选法、组织切片或体内筛选法、选择感染筛选法和蛋白质芯片筛选法等。
细胞筛选法：
细胞筛选能维持抗原和抗体的天然构象，因此在对肿瘤细胞筛选方面应用较多，该技术还适合于细胞表面受体筛选和抗原鉴定等。
但是细胞筛选存在一定的难度，由于细胞膜表面成分复杂，增加了非特异性的结合，筛选的轮次过多又容易丢失特异性结合的抗体。
为了减少非特异性结合，细胞筛选法发展出了扣除筛选、竞争筛选和内化筛选等方法。
扣除筛选是通过将抗原阴性细胞在筛选前或筛选后与抗体库结合，从而起到减少非特异性结合。
内化筛选的原理是一些与细胞表面抗原结合的抗体会进入细胞内，因此可以通过细胞的内化来进行抗体筛选。
具体操作是先用抗原阴性细胞对待筛抗体库进行扣除筛选，再将抗体库与抗原阳性细胞一起孵育，洗去细胞膜表面结合的抗体，裂解细胞获得细胞内的特异性结合抗体，随后进行扩增与下一轮筛选。
竞争筛选是将过量阴性和阳性抗原同抗体库一起孵育，而针对阳性细胞的回收方法的不同，竞争筛选又分为荧光激活细胞分离法（fluorescently-actiscvated cell sorting, FACS）和免疫磁性细胞分离法（immolunomagnetic cell separation methods）。
FACS法是将能待筛抗体标记上荧光素，洗涤，再通过流式细胞仪进行分选。
图3、竞争筛选发流程
免疫磁性细胞分离法又被称为免疫磁珠法，其原理是细胞表面抗原与连接磁珠的特异性抗体结合后能在外加磁场中停留，而不能结合的细胞则被分离出去。
图4、免疫磁性细胞分离法示意图
切片组织或体内筛选法
切片组织和体内筛选法更接近于临床应用。
切片组织筛选法是用新鲜的组织切片进行抗体筛选，但由于抗原数量有限，回收到的噬菌体抗体往往较少。
体内筛选法是将待筛抗体库静脉注射进小鼠体内，数小时后取出组织或者靶器官，回收噬菌体，如此进行3~4轮，即可
富集得到特异性的抗体。
图5、体内筛选法示意图
选择感染筛选法
噬菌体展示中最常用的为PⅢ展示，即是将外源蛋白或多肽与PⅢ的N端融合，PⅢ分子含有三个结构域，氨基端结构域（NT）N1和N2，以及羧基端结构域（CT）,NT和CT之间由富含甘氨酸的连接肽（G1和G2）相连。
在感染细菌时，这三个结构域和连接肽均起到重要作用。
选择感染筛选法（selectively infective phage，SIP）的原理是将PⅢ的NT端用特定的多肽或者蛋白取代，当这些多肽或蛋白与带有NT端的配基发生特异性结合时，该噬菌体才具有感染的能力，因此能在细菌细胞内繁殖进而被富集。
图6、选择感染筛选法示意图
蛋白芯片筛选法
蛋白芯片（protein microarray）同基因芯片的原理类似，在载体上点布上大量不同种类的蛋白质，是一种高通量的蛋白功能分析技术。
蛋白芯片筛选法能同时检测大量抗体抗原反应，通过扫描仪对荧光强度的读取，由计算机对待测样本进行分析与计算。
蛋白芯片不仅具有高通量的优点，还具有高敏性和低假阳性的特点。
图7、蛋白芯片筛选法示意图
展望
抗体库的筛选是一件费力且假阳性较高的工作，往往需要重复数轮，但是反复的筛选有可能洗脱掉一些特异性结合的噬菌体。
而随着分子生物学的发展，高通量测序的应用宣告不必再进行反复筛选。
实验证明，在进行一轮筛选后，对抗体库进行深度测序，即可准确鉴定阳性噬菌体。
图8、高通量测序在抗体库筛选中的应用
参考资料：
1、汪世华. 抗体技术[J]. 2009.
2、尹长城, 黄华樑, 阎锡蕴. 基于细胞的噬菌体抗体库筛选技术[J]. 中国生物工程杂志,
2008, 28(12):82-88.
3、魏东芝, 赖敏. 噬菌体抗体库筛选技术[J]. 生命科学, 2000, 12(3):134-136.
4、吴雯峰, 王双, 孙志伟. 噬菌体展示抗体库筛选技术研究进展[J]. 生物技术通讯, 2007,
18(3):476-479.
5、Kim D, Kim S R, Day D F, et al. A Novel Screening Method of Dextran Binding Antibody
Using Phage Display Libraries[C]. Frontiers in the Convergence of Bioscience & Information Technologies. IEEE, 2007:64-68.
6、Sasso E, Paciello R, D'Auria F, et al. One-Step Recovery of scFv Clones from
High-Throughput Sequencing-Based Screening of Phage Display Libraries Challenged to Cells Expressing Native Claudin-1[J]. Biomed Research International, 2015, 2015(6):1-9.
7、Pa T H, Jirka S M, Ten Broeke B R, et al. Phage display screening without repetitious
selection rounds[J]. Analytical Biochemistry, 2012, 421(2):622-31.
8、Hoogenboom H R. Selecting and screening recombinant antibody libraries[J]. Nature
Biotechnology, 2005, 23(9):1105.。