银杏叶部内生真菌多样性的研究

M ycosystema

菌 物 学 报 15 July 2009, 28(4): 504-511

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ISSN1672-6472 CN11-5180Q

2009 Institute of Microbiology, CAS, all rights reserved.

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Corresponding author . E-mail: chenshuanglin@

收稿日期: 2008-09-19, 接受日期: 2009-01-19

银杏叶部内生真菌多样性的研究

杜少康 陈双林* 林岱 吴鸣谦 王梅霞

南京师范大学生命科学学院 南京 210046

摘 要：为了解我国特有植物银杏的叶部组织中内生真菌菌群的多样性和演替变化，分别于春、夏、秋季从江苏和山东两省的五个主要银杏栽培地采集健康叶片进行了内生真菌的研究。结果表明：所分离出的1971株内生真菌可归于32属，以交链孢属Alternaria （18.01%）、叶点霉属Phyllosticta （14.66%）和丝核菌属Rhizoctonia （14.56%）为优势菌群。在内生真菌的类群及组成上存在着部位、地区以及季节的差异性，也呈现一定的规律性。多样性指数的计算反映出所获得的银杏叶部内生真菌菌群具有不同的丰富度及均匀度，同时有一定的相似性。 关键词：分离率，分离频率，优势菌群，多样性指数，相似性系数

Diversity of endophytic fungi in leaves of Ginkgo biloba

DU Shao-Kang CHEN Shuang-Lin * LIN Dai WU Ming-Qian WANG Mei-Xia

College of Life Science, N anjing Normal University, N anjing 210046, C hina

Abstract : Diversity of endophytic fungi in leaves of Ginkgo biloba was studied in order to understand diversity state and succession change of endophytic fungal communities in this endemic plant. Healthy leaf samples were collected from five main planting locations of G. biloba in Jiangsu and Shandong provinces separately in spring, summer and autumn. A total of 1971 strains of endophytic fungi was isolated. As a result of morphological identification 32 genera were obtained, of which Alternaria (amounting to 18.01% of the total), Phyllosticta (14.66%) and Rhizoctonia (14.56%) were dominant. The distribution and composition of endophytic fungi varied with plant organs colonized, localities and seasons, but they assumed regularity to a certain extent. Populations of endophytic fungi in different parts of the leaves indicated different abundance and uniformity but assumed similarity to a certain extent.

Key words : isolation rate, isolation frequency, dominant population, diversity index, similarity coefficient

从de Bary 在1866年指出植物中存在有内生微生物，特别是从上个世纪80年代至今，大量的植物内生真菌资源被发掘出来，从而也证实了内生真菌

在植物体内是普遍存在的（郭良栋 2001）。从不同植物中分离到的内生真菌数量不同，Fisher et al .（1993）从光叶大戟Eucalyptus nitens Maiden 上分离

到60多种内生真菌。但是仅凭种数多寡来评价某种植物的内生真菌多样性丰富与否虽然直观却不够科学、客观和准确。另一方面，已有的研究资料表明：由于协同进化的作用使得某些内生真菌具有宿主专一性，平均每种植物有4－5种专性内生真菌（Petrini 1991），因此，选择特有植物根据分离率分析内生真菌的特定组成和演替变化、运用多样性指数来评价其内生真菌的丰富度将有助于植物内生真菌多样性研究的深入。

银杏Ginkgo biloba L.是单科单属单种的多年生落叶乔木，为我国特有树种。其内生真菌的研究主要是由国内一些研究者开展，且主要集中在生物活性菌株的研究上，如对与宿主银杏相似的黄酮类化合物产生菌的分离和鉴定（王梅霞等2004；韩晓丽等2008），对产香的银杏内生镰刀菌G1024菌株的生物学特性和挥发性成分的研究（蒋继宏等2004；鞠秀云等2006），对银杏内生真菌抑菌活性的研究（申屠旭萍等2006，2007）等。在银杏内生真菌的多样性研究上，周松林等（2006）采用随机引物扩增多态性技术分析了银杏内生刺盘孢的遗传多样性，甘金莲等（2007）探讨了银杏内生真菌生态分布的一些特征，樊有赋等（2007）则研究了银杏内生真菌的种群多样性。本研究在江苏和山东两省的主要银杏栽培基地分别于春、夏、秋三季定点随机采样，通过菌种分离和鉴定以及分离率和多样性指数计算，分析了银杏叶部组织中内生真菌的组成、多样性和分布特征。

1材料与方法

1.1 材料

分别于2007年春季（5月）、夏季（8月）及秋季（11月）在5个样点（表1）采集银杏叶样品。在每一采样地点，随机选取相隔一定距离的若干健康的银杏植株采样。样品标记后置于保鲜袋中，于4℃保存，在12h之内对样品进行内生真菌的分离。

1.2 培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL，pH值自然，临用时加250mg/L链霉素。

1.3 内生真菌的分离、纯化及保藏

采用常规的真菌组织分离法（方中达1998）。叶片剪成0.5cm×0.5cm左右的组织小块，叶柄剪成1cm长的小段。每次分离均选取叶片组织块200个，叶柄组织块50个。

表1 银杏叶组织采样地点及其生境

Table 1 Sampling site and habitat of the leaves of Ginkgo biloba

采样地点

Sampling site

采样生境

Habitat

江苏南京

Nanjing, Jiangsu

公园

Park

江苏泰兴

Taixing, Jiangsu

种植园

Plantation

江苏启东

Qidong, Jiangsu

公园

Park

江苏邳州

Pizhou, Jiangsu

种植园

Plantation

山东郯城

Tancheng, Shandong

种植园

Plantation

1.4 内生真菌的鉴定

依照真菌的经典分类鉴定方法，从纯化后培养数日的菌落上挑取菌体制成切片，置于光学显微镜下观察菌丝、有性或无性孢子、产孢结构等的形态特征，鉴定到属。真菌分类鉴定的工具书主要为《真菌鉴定手册》（魏景超1979），半知菌的鉴定则主要依据Barnett & Hunter（1998）的系统，并根据Kirk et al.（2001）追寻属的变动采用目前的属名和定义。

1.5数据处理

采用分离频率比较判断优势菌群。分离频率（isolation frequency，IF）：分离到的某一指定类型内生真菌的菌株数占分离总的内生真菌菌株数的百分率。

采用分离率衡量植物组织中内生真菌的丰富程度和每个组织块受多重侵染的发生频率。分离率（isolation rate，IR）：分离到的某一指定类型内生真菌的菌株数占分离样品组织块总数的百分率。

采用Shannon-Wiener指数（H）和Simpson指数（D）分析内生真菌的群落生物多样性。H=-Σ(Pi)(ln Pi)、D=1-Σ(Pi)2，式中：Pi为属于种i的个体在全部个体中的比例；采用Evenness指数（J）分析群落物种分布的均匀程度。J=H/lnS，式中：H为

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