紫杉醇的合成

2.重组菌的构建及影响
图1.在下游途径恒定的情况下改变上游途径的强度对紫杉二烯积累的影响
图2.在恒定的上游途径下依赖于下游途径的紫杉二烯的变化
图3.在两个不同的下游途径表达（31和61个任意单位）及菌株1724的上游途径高度过表达时紫杉二烯的变化；
图4.通过增强启动子使两个不同的下游途径表达（31和61个任 意单位）来调整上游途径基因的整合
Author: Parayil Kumaran Ajikumar, Wen-Hai Xiao, Keith E. J. Tyo, et al
Journal: Science,2010,33:7-74
IF: 29.747(2009)
Department of Chemical Engineering, Massachusetts Instituteof Technology (MIT), Cambridge, MA 02139, USA.
紫杉醇前体分子紫杉二烯在大肠杆菌中 过表达时的途径优化
报告:新乡医学院生科院 2013.12
汇报提纲
研究简介
研究内容 研究结果
研究展望
文献出处：
Isoprenoid Pathway Optimization for Taxol Precursor Overproduction in Escherichia coli
⑥
1- 羟基-2- 甲基-2-(E)- 丁烯基 4- 二磷酸
⑦
焦磷酸异戊烯酯，IPP
⑧
焦磷酸二甲烯丙酯,DMAPP
⑨
牛儿苗基牛儿苗基焦磷酸,GCPP
⑩
紫杉二烯
紫杉烷碳环系统的生物 巴卡亭III 合成、侧链的生物合成、 紫杉烷系统和侧链的酯 紫杉醇 化反应
立体选择性氧化、酰 化和苯甲酰化
紫杉二烯合成的10种酶 1.脱氧木酮糖-5- 磷酸合酶； 2.脱氧木酮糖磷酸盐还原异构酶； 3.4- 二磷酸胞苷-2-C- 甲基-D- 赤藓醇合酶； 4.4- 二磷酸胞苷-2-C- 甲基赤藓糖激酶； 5.2-甲基赤藓糖-2,4- 环二磷酸合酶； 6.1- 羟基-2- 甲基-2-(E)- 丁烯基 4- 二磷酸合 酶； 7.异戊烯基单磷酸激酶； 8.异戊烯基二磷酸异构酶； 9.牛儿苗基焦磷酸合酶； 10.紫杉二烯合酶
研究内容
1.代谢途径多模块组合模式(MEP)
两大模块中的10种酶 1.脱氧木酮糖-5- 磷酸合酶； 2.脱氧木酮糖磷酸盐还原异构酶； 3.4- 二磷酸胞苷-2-C- 甲基-D- 赤藓醇合酶； 4.4- 二磷酸胞苷-2-C- 甲基赤藓糖激酶； 5.2-甲基赤藓糖-2,4- 环二磷酸合酶； 6.1- 羟基-2- 甲基-2-(E)- 丁烯基 4- 二磷酸合 酶； 7.异戊烯基单磷酸激酶； 8.异戊烯基二磷酸异构酶； 9.牛儿苗基焦磷酸合酶； 10.紫杉二烯合酶
二萜共同前体
甲戊二羟酸途径MVA(Mevalonic acid)途径
甲基赤藓醇磷酸途径(MEP)
丙酮酸
①
甘油醛-3-磷酸
1- 脱氧- 木酮糖-5- 磷酸
②
2C- 甲基-D- 赤藓醇-4- 磷酸
③源自文库
4- 二磷酸胞苷-2-C- 甲基赤藓醇
④
4- 二磷酸胞苷-2-C- 甲基-D- 赤藓醇-2- 磷酸
⑤
2C-甲基-D- 赤藓醇2,4- 环二磷酸
谢谢 ！
•菌株8的上游途径中插入一个trc启动子后比仅在MEP途径 下表达的原始菌株1的紫杉二烯产量高2000倍。此外，如果 在将下游合成操纵子的基因顺序进行改变，比如将 GT(GGPS-TS)变为TG(TSGGPS)，结果会引起紫杉二烯产量增 加2-3倍；
• 紫杉二烯的积累与代谢途径副产品间呈负相关，副产品主要 为吲哚； •对于产紫杉醇的工业微生物的构建最关键的步骤是菌体 内CYP450酶的氧化反应设计，第一步是由细胞色素P450 单加氧酶和紫杉二烯-5α-羟化酶参与的氧化反应，这种 特异的单加氧酶能够通过羟基化反应使二萜类前体分子 紫杉烯的双键发生迁移；
E.重组大肠杆菌K12MG1655 DrecADendA；EDE3-重组大肠杆 菌K12MG1655 DrecADendA在 RNA聚合酶的作用下将DE3 T7启 动子结合；MEP, dxs-idi-ispDF 启 动子; GT, GPPS-TS 启动子; TG, TS-GPPS启动子; Ch1,染色体1个拷 贝; Trc, Trc启动子; T5, T5启动子; T7, T7 启动子; p5, pSC101 质粒; p10, p15A 质粒; p20, pBR322 质粒
研究简介
手术治疗 放疗化疗
癌细胞
生物治疗
化疗药物

植物提取


化学合成
微生物工程 紫杉醇
紫杉醇分子结构
巴 卡 亭 Ⅲ
5β，20-环氧-1，2α，4，7β，10β，13α-六羟基紫 杉烷-11-烯-9-酮-4，10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13
两种合成途径 糖代谢产物 乙酰辅酶A硫解酶、 HMGCoA合成酶 HMG-CoA还原酶 焦磷酸化和脱羧作用： IPP(C5) 异戊二烯转化酶 异戊二烯转移酶
•在构建的基因工程菌大肠杆菌中紫 杉二烯的最大表达量接近于1g/L
研究展望
1.为了完成合适的紫杉醇前体分子即巴卡亭3，需要六步以 上的羟基化反应和其他的反应步骤，包括一些尚不清楚的 过程都需要有效地在基因工程菌中实现；
2.解开MEP途径在萜类化合物合成中的潜能，是一个 新的且更有效的萜类合成路线，以萜类化合物潜在的工 业化微生物生产可提供有用的化学药品和燃料。
图5.32株菌株基因型的构建
图6 At8T5aOH、At24T5aOH和 At42T5aOH -TCPR嵌合 体酶的结构模式
研究结果
•上游途径的基因表达从低水平开始增加时，紫 杉二烯的产量也同时增加，这是由于在整个反应 途径中前体分子的供给提高。但上游途径的中间 产物的进一步增加不能被下游途径完全容纳； •对于恒定的上游途径的表达，在下游途径中的 表达同样可观察到最初紫杉二烯的量被下游途 径的低表达量所限制，在下游途径高水平表达 时，对微生物细胞的生理代谢有消极影响；
图7 补料分批式培养的基因工程菌在1L发酵罐中的发酵情况
•通过跨膜转运工程（TM）和CYP450酶类嵌合体的产生，使 某些植物的CYP450和细胞色素还原酶(CPR)已可在大肠杆菌 中表达为生物合成的功能性分子，构建了嵌合体酶 At24T5aOH-tTCPR，使第一步氧化反应能高效地进行，导致 至少98%的紫杉二烯转化为紫杉二烯-5α-醇，并有少量环己 烷产生，嵌合体酶At24T5aOH-tTCPR产生紫杉二烯-5α-醇的 能力提高了两倍以上，达到了21mg/L ； • 嵌合体酶的的表达功能可变，如可构建为At8T5aOH-tTCPR, At24T5aOH-tTCPR及 At42T5aOH-tTCPR，导致出现了复杂的结构重 排使紫杉二烯被环醚化。此时副产物产生的量与紫杉二烯-5α-醇 的量基本相同，接近于24mg/L。