质粒提取、定量与酶切鉴定

影响迁移率的因素？
电场 大小（分子量）
样品： 形状（构型）
电荷
质粒DNA三种构型：
共价闭环超螺旋 线性 开环的双链环状
共价闭环超螺旋DNA＞线性DNA＞开环的双链环状DNA
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琼脂糖凝胶浓度与DNA分子的有效分离范围
胶浓度（％）
0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
线性DNA分子大小 （kb） 5～60 1～20 0.8～10 0.5～7 0.4～6 0.2～4 0.1～3
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数据处理
样品编号
质粒DNA的 浓度(µg/ml)
Ratio值
A260/A280
1 2 3 平均值
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18
三、质粒DNA的酶切分析
• 质粒 DNA: ～3 kb
载体: pMD18-T 2.7kb 基因: CHD5 0.4 kb
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限制性内切酶
• 限制酶特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的 特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上，并在此切 割双链DNA。
12，000rpm 2 min
7. 洗脱
50μl 取吸附柱至 另一新EP管 洗脱液Eluent
室温静置 12，000rpm
1min
1 min 收集洗脱液备用
二、质粒DNA定量测定
基本原理
利用核酸在260nm处有紫外吸收的特性
紫外分光光度计
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操作步骤
1. 取5l提取的质粒DNA，加入95l蒸馏水 2. 混合均匀 3. 用紫外分光光度计测定A260
4. 中和 350μl 中和液S3
温和地 颠倒混匀6-8次
至出现白色
5. 过柱分离 12，000rpm
10 min 取700μl上清至 吸附柱管
12，000rpm
30s
弃滤液
絮状沉淀
6. 洗柱 12，000rpm
600μl
600μl
30s 弃滤液
漂洗液W2
去蛋白液W1
12，000rpm
30s
弃滤液
空柱
反应物
体积（µl)
10× M 酶切缓冲液
2
质粒DNA
10
Hind III
1
EcoR I
1
H2O
6
混合后37 ℃水浴1～2h
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•影响酶切反应的因素
底物DNA的纯度 反应系统：(反应缓冲液) 反应体积： 甘油浓度<5% 保温时间与温度
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四、琼脂糖凝胶电泳
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电泳：带电粒子在电场中泳动的现象
本次电泳使用1.0%琼脂糖凝胶
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琼脂糖凝胶电泳操作
• 琼脂糖凝胶的制备 • 上样：加样前，样品先与6×上样缓冲液混匀 • 电泳 ：电压100v；30min • 结果观察：凝胶成像仪
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琼脂糖凝胶电泳上样
-
1234
+
每组上2个样品
1：DNA Marker（ 5 l ） 2：提取的质粒DNA （ 5 l ） 3：质粒DNA酶切产物 （ 10 l ）
离心
染色体DNA与不稳定的大分子RNA、
蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来
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试剂盒的组成：
溶液S1（细菌悬浮液）
裂解液S2
中和液S3 去蛋白液W1 漂洗液W2 洗脱液 RNase A(100mg/ml) DNA吸附柱
溶液S1： 50 mmol/L 葡萄糖 10 mmol/L EDTA 25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) 2毫克/毫升 溶菌酶
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紫外光吸收法：
DNA或RNA的定量 A260=1.0相当于 50μg/ml双链DNA 40μg/ml单链DNA（或RNA） 20μg/ml寡核苷酸
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DNA或RNA的纯度判定
DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0
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质粒DNA的提取、定量 与酶切鉴定
Extraction and Identification of Plasmid DNA
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1
实验流程图
一、碱裂解法提取质粒
二、质粒定量
最后做
三、质粒酶切
四、酶切产物的琼脂糖电泳检测
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2
实验目的
• 掌握碱裂解法提取质粒的方法 • 掌握紫外吸收测定DNA的方法 • 了解质粒酶切鉴定原理 • 掌握琼脂糖凝胶电泳技术
• 分子克隆中常用的为II型限制酶，其识别位点长度为 4～6个核苷酸的反向重复序列。
GGATCC CCTAGG
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EcoRⅠ和HindⅢ的识别序列和切口是： • EcoRⅠ：G↓AATTC • HindⅢ：A↓AGCTT
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pMD18-T
精选课件
22
质粒DNA的酶切分析操作
在一个洁净的1.5Baidu Nhomakorabeaml离心管中混匀下列反应物：
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33
DNA Marker (ladder)
精选课件
3
pMD18-T
精选课件
4
实验材料
• 大肠杆菌DH5a菌株 • pMD18-T载体 • Axygen质粒小量提取试剂盒
• Takara EcoRI 限制性内切酶 • Takara Hind III 限制性内切酶 • Takara 10 × M 酶切缓冲液
• BioWest电泳琼脂糖干粉 • 0.5×TBE核酸电泳缓冲液 • EB 核酸荧光染料 精选课• 件Takara 6 × 电泳上样缓冲液 5
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9
碱裂解法基本原理
基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的 差异而达到分离目的。
pH =12.6（碱性）
pH=中性
染色体DNA：氢键断裂，变
性。
NaAc溶液
质粒DNA：大部分氢键断裂，（pH4.8） 但超螺旋共价闭合环状的两 条互补链不会完全分离。 （不完全变性）
质粒DNA：复性，溶于溶液中 染色体DNA：不能复性；形成缠连 的网状结构。
裂解液S2：200 mmol/L NaOH 1% SDS
中和液S3： 3 mol/L KAc (pH4.8)溶液
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1. 收集细胞
12000rpm
1.5mL 菌液
菌体沉淀
1 min
实验流程
3. 裂解细胞
2. 悬浮细胞
250μl
250μl
剧烈震荡
溶液S1
裂解液S2
颠倒混匀4-6次
室温静置 2min
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6
实验仪器
• 微量移液器 • 离心机 • 恒温水浴箱 • 紫外检测仪 • 电泳仪 • 水平电泳槽
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7
一、碱裂解法提取质粒DNA
• 独立于细菌染色体 以外，能独立自主 复制的闭合环状 DNA分子
• 基因工程常采用的 载体
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8
质粒提取方法：
• 碱裂解法； • 煮沸裂解； • 羟基磷灰石柱层析法； • 质粒DNA释放法； • 酸酚法等