发酵工程_青霉素的制备

--青霉素类抗生素
青霉素简介
化学结构 理化性质
青霉素合成及调控
生物合成 生物合成的调控
青霉素发酵生产工艺
菌种 发酵工艺流程 培养基 发酵培养控制
青霉素简介
青霉素的发现
1929年英国学者 弗莱明首先在抗 生素中发现了青 霉素，英国谢菲 尔德大学病理学 家弗洛里实现对 青霉素的分离与 纯化。
青霉素的生物合成与糖分解代谢 的关系
青霉素的生物合成受糖分解代谢产物 的阻遏，如合成青霉素的酰基转移酶就会 被阻遏。在青霉素发酵过程中，发现能被 青霉素迅速利用的葡萄糖有利于菌体生长， 但抑制青霉素的合成，而被缓慢利用的乳 糖，却是生产青霉素的最好碳源。
乳糖比葡萄糖优越的主要原因是乳糖 被水解成单糖的速度正好符合青霉素生产 期合成青霉素的需要，而又不会产生高浓 度的分解产物来抑制青霉素的合成，因此， 碳源多用葡萄糖加乳糖或利用某些非糖原 料如植物油等。但由于乳糖价格较贵，成 本较高，故在生产实践中常通过间隙或滴 加葡萄糖的方法控制培养液中糖的含量， 以符合菌体生长和青霉素生物合成的需要。 这样，可以降低成本，提高产量。
• 基质浓度：在分批发酵中，常常因为前期 基质量浓度过高，后期基质浓度低，对生 物合成酶系产生阻遏或对菌丝生长产生抑 制。为了避免这一现象,在青霉素发酵中 通常采用补料分批操作法,即对容易产生 抑制和限制作用的基质维持一定的最适浓 度。 • 温度：青霉素发酵的最适温度一般认为应 在25 °C 左右。温度过高将明显降低发 酵产率,同时增加葡萄糖的维持消耗, 降 低葡萄糖至青霉素的转化率。
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菌丝浓度：发酵过程中必须控制菌丝浓度不 超过临界菌体浓度, 从而使氧传递速率与氧 消耗速率在某一溶氧水平上达到平衡。 菌丝生长速度：在葡萄糖限制生长的条件下， 当比生长速率低于0.015h-1时，比生产速率 与比生长速率成正比。因此, 要在发酵过程 中达到并维持最大比生产速率,必须使比生长 速率不低0.015h-1。 菌丝形态：青霉素产生菌分化主要呈丝状生 长和结球生长两种形态。在丝状菌发酵中, 控制菌丝形态使其保持适当的分支和长度, 并避免结球 , 是获得高产的关键要素之一。 而在球状菌发酵中, 使菌丝球保持适当大小 和松紧,并尽量减少游离菌丝的含量, 也是充 分发挥其生产能力的关键素之一。
• 碳酸钙：用来中和发酵过程中产生的 杂酸，并控制发酵液的pH值。 • 苯乙酸/苯乙酰胺：可以借酰基转移的 作用，将苯乙酸转入青霉素分子，提 高青霉素的生产强度。 • P和S：为菌体提供营养的无机磷源一 般采用磷酸二氢钾。另外加入硫代硫 酸钠或硫酸钠以提供青霉素分子中所 需的硫。
• 另外，由于在发酵过程中二氧化碳的不断产 生，加上培养基中有很多有机氮源含有蛋白 质，因此在发酵罐内会产生大量泡沫，如不 严加控制，就会产生发酵液逃液，导致染菌 的后果。采用植物油消沫是个好方法，一方 面作为消沫剂，另一方面还可以起到碳源作 用。 • 由于现在还有一些工厂采用铁罐发酵，在发 酵过程中铁离子便逐渐进入发酵液。发酵时 间愈长，则铁离子愈多。铁离子过多会影响 青霉素的合成。采用铁络合剂以抑制铁离子 的影响，但实际对青霉素产量并无改进。所 以青霉素的发酵罐采用不锈钢制造为宜。
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发酵培养控制
加糖控制。残糖降至0.6%，pH上升时加糖 补氮及加前体。补氮：硫酸铵、氨、尿素，使发 酵液氨氮量控制在0.01%~0.05%。前体：发酵液中 残存乙酰胺浓度为0.05%~0.08%。 pH控制。6.6~6.4 温度。前期25℃ ~26℃ ，后期23℃ 。 溶解氧。不低于饱和溶解氧的30%。 泡沫的控制。
青霉素生产发酵工艺
菌种
目前国内青霉素生产菌按其在深层培 养中菌丝的形态分为丝状菌和球状菌两种， 根据丝状菌产生孢子的颜色又分为黄孢子 丝状菌和绿孢子丝状菌，常用菌种为绿孢 子丝状菌，如产黄青霉素。
青霉素产生菌的生长过程
分生孢子发芽期 菌丝繁殖期
菌丝生长期
脂肪粒形成期 脂肪粒减少，小空孢
青霉素分泌期
青霉素生产工艺过程
抗生素制备的一般流程图
菌种 孢子制备 种子制备 发酵阶段
前体
发酵
发酵液预处理及种子加滤
提取及精制 提取阶段 成品检验 成品包装
发酵工艺流程
青霉素菌种发酵工艺的原理
一、总述
• 青霉素发酵——将青霉菌接种到固体培养 基上培养一段时间，得到青霉菌孢子培养 物。用无菌水将孢子制成悬浮液接种到种 子罐内已灭菌的培养基中，通入无菌空气 搅拌，培养。然后将种子培养液接种到发 酵罐已灭菌的含有苯乙酸前体的培养基中， 通入无菌空气搅拌，培养。
青霉素的化学结构
青霉素是含有青霉素母核的多种化 合物的总称，青霉素发酵液中至少含有 5种以上的不同的青霉素：青霉素F、青 霉素X、青霉素K及二氢青霉素F等。
青霉素分子结构球棍模型
青霉素合成及调控
青 霉 素 的 生 物 合 成
青霉素的生物合成与赖氨酸的反馈调节
用产黄霉菌生产青霉素要受到赖氨酸的阻 遏，这是由于其赖氨酸生物合成途径的初始 酶——高柠檬酸合成酶受到了赖氨酸反馈阻遏。 在赖氨酸生物合成途径中，从氨基己二酸 分支而产生青霉素，这种赖氨酸阻遏是初级代 谢调节的效果用到次级代谢上的最好的例子。
大空孢
自溶
菌丝自溶期
培养基
碳源青霉菌能利用多种碳源如乳糖、蔗糖、葡萄 糖等。目前采用淀粉水解糖，糖化液进行流加。 氮源可采用玉米浆、花生饼粉、精制棉籽饼粉或 麸皮粉等有机氮源，及氯化氨、硫酸氨、硝酸氨 等无机氮源。 前体为生物合成含有苄基基团的青霉素G，需要 在发酵中加入前体如苯乙酸或苯乙酰胺。由于它 们对青霉素有一定毒性，故一次加入量不能大于 0.1%，并采用多次加入方式。 无机盐包括硫、磷、钙、镁、钾等盐类。铁离子 对青霉素有毒害作用，应严格控制发酵液中铁含 量在30ug/mL以下。
• pH值：青霉素发酵的最适pH 值一般认为 在6.5左右, 应尽量避免 pH 值超过7.0。 因为青霉素在碱性条件下不稳定,容易加 速其水解。 • 溶氧:对于好氧的青霉素发酵来说,溶氧 浓度是影响发酵过程的一个重要因素。 当溶氧浓度降到30%饱和度以下时,青霉 素产率急剧下降,低于10%饱和度时,则造 成不可逆的损害。溶氧浓度过高,说明菌 丝生长不良或加糖率过低,造成呼吸强度 下降,同样影响生产能力的发挥。
青霉素发酵过程中的代谢变化分为菌体生长、 青霉素合成和菌体自溶三个阶段。
• • 菌体生长阶段：发酵培养基接种后生产菌在合 适的环境中经过短时间的适应，即开始发育、 生长和繁殖，直至达到菌体的临界浓度。 青霉素合成阶段：这个阶段主要合成青霉素， 青霉素的生产速率达到最大，并一直维持到青 霉素合成能力衰退。在这个阶段，菌体重量有 所增加，但产生菌的呼吸强度一般无显著变化。 菌体自溶阶段：这个阶段菌体衰老，细胞开始 自溶，合成青霉素能力衰退，青霉素生产速率 下降，氨基氮增加，PH上升。
二、 青霉素发酵过程
• 青霉素发酵时，青霉素生产菌在合适的培养基、PH、温度 和通气搅拌等发酵条件下进行生长并合成青霉素。 • 发酵开始前，有关设备和培养基（主要是碳源、氮源、前 体和无机盐等）必须先经过灭菌，后接入种子。 • 在整个过程中，需要不断通气和搅拌，维持一定的罐温和 罐压，在发酵过程中往往要加入泡沫剂，假如酸碱控制发 酵液的PH，还需要间歇或连续的加入葡萄糖及铵盐等化合 物以补充碳源及氮源，或补进其他料液和前体等以促进青 霉素的生产。