分子标记在玉米遗传育种中的应用和发展

分子标记在玉米遗传育种中的应用和发展

传统的育种主要依赖于植株的表现型选择。环境条件、基因间互作、基因型与环境互作等多种因素会影响表型选择效率。例如玉米抗病性的鉴定就受发病的条件、植株生理状况、评价标准等影响；玉米品质、产量等数量性状的选择、鉴定工作更困难。一个优良品种的培育往往需花费7～8年甚至十几年时间。如何提高选择效率，是育种工作的关键。育种家在长期的育种实践中不断探索运用遗传标记来提高玉米育种的选择效率与育种预见性。遗传标记通常包括形态学标记、细胞学标记、生化标记与分子标记。棉花的芽黄、番茄的叶型、抗TMV的矮黄标记、水稻的紫色叶鞘等形态性状标记，在育种工作中曾得到一定的应用。以非整倍体、缺失、倒位、易位等染色体数目、结构变异为基础的细胞学标记，在小麦等作物的基因定位、连锁图谱构建、染色体工程以及外缘基因鉴定中起到重要的作用，但玉米类许多作物难以获得这类标记。生化标记主要是利用基因的表达产物如同工酶与贮藏蛋白，在一定程度上反映基因型差异，它们在小麦、玉米等作物遗传育种中得到应用。但是它们多态性低，且受植株发育阶段与环境条件及温度、电泳条件等影响，难以满足遗传育种工作需要。以DNA多态性为基础的分子标记，目前已在作物遗传图谱构建、重要农艺性状基因的标记定位、种质资源的遗传多样性分析与品种指纹图谱及纯度鉴定等方面得到广泛应用，尤其是分子标记辅助选择育种更受到人们的重视。

分子标记的类型和特点:按技术特性，分子标记可分为三大类。第一类是以分子杂交为基础的DNA标记技术，主要有限制性片段长度多态性标记(Restrictionfragmentlengthpolymorphisms，RFLP标记)；第二类是以聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction，PCR反应)为基础的各种DNA指纹技术。PCR是Mullis等(1985)首创的在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的体外酶促反应，合成特异DNA片段的一种方法。PCR技术的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合。PCR反应分变性(denaturation)、复性(annealling)、延伸

(exten—sion)三步。变性指的是通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA的过程；复性(又称退火)是指当温度降低时，单链DNA回复形成双链的过程，由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物DNA大大高于模板DNA，容易使引物和其互补的模板在局部形成杂交链；延伸是指在DNA聚合酶和4种脱氧核糖核苷三磷酸底物及Mg2+存在的条件下，在聚合酶催化下进行以引物为起始点的5'-3'的DNA 链延伸。以上三步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，经25～30个循环后，介于两个引物之间的特异DNA片段得到大量的复制，数量可达2×106-7拷贝。按照PCR所需引物类型又可分为：①单引物PCR标记，其多态性来源于单个随机引物作用下扩增产物长度或序列的变异，包括随机扩增多态性DNA标记(Random别amplificationpolymorphismDNA，RAPD)、简单重复序列中间区域标记(1nter-simplesequencerepeatspolymorphisms，ISSR)等技术；②双引物选择性扩增的PCR标记，主要通过引物3'端碱基的变化获得多态性，这种标记主要指扩增片段长度多态性标记(Amplifiedfragmentlengthpolymorphisms，AFLP)；③需要通过克隆、测序来构建特殊双引物的PCR标记如简单序列重复标记(Simplesequencerepeats，SSR)、序列特征化扩增区域(Segion，简称SCAR技术)和序标位(Sequence—taggedsites，简称STS)等。第三类是一些新型的分子标记，如单核苷酸多态性(Singlenucleotidepolymorphism，SNP)，由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基的转换、颠换以及单碱基的插入或缺失等。表达序列标签(Expressedsequencestags，EST)是在cDNA文库中随机挑选克隆，并进行单边测序(Singlepasssequence)而产生的300～500bp的核苷酸片段。应用于分子标记辅助育种的标记主要有RFLP、RAPD、SSR、AFLP、STS等。

遗传连锁图谱是指通过遗传重组分析得到的基因在染色体上的线形排列图，基因间的距离通常用遗传重组值来表示。高密度分子标记遗传连锁

图谱的构建，可为基因定位、物理图谱构建和以图谱为基础的目的基因克隆奠定基础，还可为分子标记辅助选择创造条件。遗传图谱既是遗传研究的重要内容，又是作物资源、育种及分子克隆等许多应用研究的理论依据和基础。20世纪80年代，分子标记技术的发展促进了遗传连锁图谱的构建，在玉米图谱构建方面，从1986年Helentjaris等利用500～1000bp简单序列克隆出100多个H247×761的F2群体，建立了首张玉米RFLP图谱(113个RFLP标记位点)以来，玉米分子标记遗传图谱构建的研究进入飞速发展阶段。Song等构建了包含151个SSR标记位点的高油玉米遗传图谱，图谱总长度为1759.1cm，相邻两标记间的平均距离为

11.65cm，定位了27个数量性状位点。王凤格等构建了具有65个SSR位点的遗传图谱，覆盖玉米基因组1333.3cm，标记间平均距离20.5cm，定位了抗甘蔗花叶病毒的数量性状位点。赵茂俊等构建包含146个SSR标记位点的遗传连锁图谱，覆盖玉米基因组166cm，平均图距11。4cm，将检测到的6个数量性状位点定位到第2、6、10染色体上。张春庆等对玉米AFLP指纹图谱的引物选择进行了研究，选出了多态性强、谱带数目多、且质量好的两引物组合，作为玉米AFLP指纹的高多态引物。向道权等构建了具有80对SSR标记的玉米遗传图谱，标记间平均距离25.42cm，覆盖了玉米基因组的2033.4cm，定位了8个数量性状位点。赵久然等筛选确定了适合中国主要玉米杂交种及其双亲的RAPD的特异引物，建立了相应的遗传图谱，并且应用在很多研究中。陈一华等对12个优良玉米自交系的DNA进行RAPD标记分析，获得了它们的遗传图谱，并建立了自交系的计算机化的遗传图谱。随着分子生物学技术的发展，遗传图谱的构建将更加完善，特别是在建立完整高效的分子标记辅助选择体系方面。

分子标记辅助选择育种

选择是育种中最重要的环节之一。在传统育种中，常根据表型来进行选择方法，存在许多缺点，效率较低。要提高选择的效率，最理想的方法应是能够直接对基因型进行选择。分子标记为实现对基因型的直接选择提供了可能，因为分子标记的基因型是可以识别的。如果目标基因