黄芪总皂苷的纯化工艺研究

吸收度（A） 0.2720 0.3426 0.4200 0.4926 0.5626 0.6360
结果表明，在 0.08034～0.17304mg 范围内，黄芪甲苷量(mg)与吸收度(A)线性关系良好。 测定法：取一定量黄芪总皂苷粉末加水饱和正丁醇 20ml，微热使溶解，转移至分液漏 斗，加入 1%氢氧化钠萃取，萃取 3 次，每次 10ml，弃氢氧化钠液，正丁醇液用正丁醇饱和 水洗至中性，弃水液，蒸干正丁醇液，残渣加甲醇使溶解并稀释至 100ml，精密移取 1ml， 依法测定吸光度，计算，即得。
10ml 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。精密量取 1.5ml，置 25ml 量瓶中，加甲醇至刻度，摇
匀，即得（每 1ml 含黄芪甲苷 0.0618mg）。
检测波长的选择：取按标准曲线制备项下制备的黄芪甲苷对照品显色溶液在 370-800nm
进行波长扫描，最大吸收波长为 560nm，选择 560nm 作为测定波长。
在前期研究中发现黄芪浸膏在碱液处理后黄芪总皂苷的含量（纯度）较高，有工业化应 用的前景，本文采用正丁醇动态萃取-碱液处理-丙酮沉淀的技术路线，采用 ICH 推荐的第三 类低毒溶剂作为纯化用溶剂，在工艺中也可采用食品添加剂级正丁醇、食品加工助剂级及医 药级丙酮作为纯化溶剂，有利于推广应用到其它含有相似皂苷类型的中药品种及天然植物提 取物的纯化，采用减压干燥方法也有助于控制溶剂残留。
4. 试验方法与结果
4.1 黄芪总皂苷纯化工艺
从预试工艺路线分析：大孔吸附树脂纯化方法主要是除去糖类等杂质，在吸附处理过程
中消耗树脂、乙醇量较大，工时消耗较大；通过正丁醇同样可以达到除去糖类杂质的目的，
因此合并考虑，纯化工艺的关键为碱化处理萃取纯化，而丙酮处理为经验的总皂苷处理方法。
在预试验的基础上确定试验研究的因素水平设置，以氢氧化钠作为碱化试剂，药液体积
本文采用的动态萃取方法为搅拌萃取，在工业用途及中试研究中，可以根据设备的具体 条件采用多种动态萃取方法，也可以在本文研究思路的基础上采用多相溶剂萃取等现代提取 物制备工艺方法进行改进。
8. 致谢
成都中医药大学民族医药研究所的在读硕士研究生何凡、吴怡、谭承佳参与了本研究的
-4-
部分工作。
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1. 引言
黄芪为常用中药，为豆科植物膜荚黄芪 Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干 燥根，具有补气固表、利尿托毒、排脓、敛疮生肌等功能[1]。
国内外对其同属植物的化学成分进行了较多的研究[2]，其中黄芪总皂苷在免疫调节、心 肌缺血保护等方面有显著活性[3]，为黄芪的主要活性部位，采用黄芪甲苷及黄芪总皂苷作为 黄芪药材质量评价的指标，两种含量之间存在相关性，即黄芪甲苷的含量越高，总皂苷的含 量就越高[4]，黄芪总皂苷可以作为含黄芪制剂的质量控制指标[5][6]。
45.59
5
300
4
2
200
53.35
6
350
6
4
200
48.38
7
400
8
2
250
60.66
8
450
10
4
250
55.38
*因黄芪总皂苷部位（浸膏粉）收率低，在粉碎过程中损失较大，因此在考察中未对部位收率作考察。
4.2 黄芪总皂苷含量测定方法[10]
对照品溶液的制备：精密称取在 120℃减压干燥至恒重的黄芪甲苷对照品 10.3mg，置
水平，以总皂苷含量为考察指标，对黄芪总皂苷的纯化工艺进行研究。
表 1 黄芪总皂苷纯化工艺的因素水平设置
因素/水平
1
2
3
4
5
6
7
8
药液浓度（g/200ml） 100
150
200
250
300
350
ห้องสมุดไป่ตู้
400
450
氢氧化钠用量（g）
4
6
8
10
正丁醇萃取次数（次） 2
3
4
5
正丁醇萃取用量（ml） 100
150
200
250
试验方法：
称取黄芪粗粉 5000g，按文献报道的乙醇提取工艺[10]，浓缩至每 1ml 含原生药 2.25g 的
流浸膏，备用。
按均匀试验各序号取定量，加水稀释至规定的含原生药量；加入规定量的氢氧化钠，电
动恒速搅拌使溶解；加入水饱和正丁醇电动恒速搅拌动态萃取规定次数，水饱和正丁醇用量
为规定量，分取正丁醇液；加氢氧化钠溶液（浓度与前加碱浓度一致）200ml，动态洗涤 1
序号
药液浓度 X1 （g/200ml）
氢氧化钠用量 X2 （g）
正丁醇萃取次数 X3 （次）
正丁醇萃取用量 X4 总皂苷含量* Y
（ml）
（%）
1
100
4
3
100
50.52
2
150
6
5
100
36.29
3
200
8
3
150
54.85
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4
250
10
5
150
照紫外-可见分光光度法项下比色法（中国药典 2005 年版一部附录 V A），在 560nm 波 长处测定吸收度，以吸收度 A 为纵坐标、黄芪甲苷量 mg 为横坐标，绘制标准曲线。
表 3 线性关系的考察 黄芪甲苷量（mg） 0.08034 0.09888 0.11742 0.13596 0.15450 0.17304
3. 仪器与试剂
仪器：Spectrumlab22PC 分光光度计（上海棱光技术有限公司）；Lambda35 紫外可见分 光光度计（Perkin Elmer 公司）；CQ-250 型超声处理波清洗器(上海之信超声处理有限公司)； SartoriusBP21ID、BP121S 电子天平(北京赛多利斯仪器有限公司)；DL-360A 超声处理波提 取器（上海之信仪器有限公司）；W201 恒温水浴锅（上海申顺生物科技有限公司）；ZDHW
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黄芪总皂苷的纯化工艺研究1
赖先荣 1，吴秦西 2，向永臣 1
1 成都中医药大学 四川成都 611137 2 成都市第五人民医院 四川成都 611130
E-mail：laixianrong@163.net
摘 要： 目的：优化黄芪总皂苷的纯化工艺。方法：以总皂苷含量为指标，采用均匀设计 法对黄芪总皂苷的纯化工艺参数进行优化。结果：最佳纯化工艺条件为：药液浓度为 1g 原 生药/ml，加入氢氧化钠至 5%，加入水饱和正丁醇动态萃取 2 次，每次 1.25 倍量，加 5%氢 氧化钠溶液 1 倍量动态洗涤 1 次，加水 1 倍量动态洗涤 2 次，调节正丁醇溶液 pH 至中性。 优化条件下的验证试验得到的黄芪总皂苷含量平均值为 65.23%（n=3）。结论：建立的黄芪 总皂苷的纯化工艺稳定、可行，适合放大生产。 关键词：黄芪，总皂苷，纯化工艺，均匀设计 中图分类号：R 284.2
黄芪总皂苷的纯化工艺主要有大孔吸附树脂纯化工艺[7]和大孔吸附树脂结合碱水解[8]两 种工艺。本文以总皂苷含量为考察指标，采用正交试验法考察了黄芪的醇回流提取工艺及其 工艺参数，采用均匀设计法考察了黄芪的正丁醇萃取-碱处理纯化工艺及其工艺参数。
2. 研究原料
试验研究用黄芪药材购自甘肃武威，为豆科植物膜荚黄芪 Astragalus membranaceus （Fisch.）Bge.的干燥根，符合中国药典 2005 年版一部黄芪项下的有关规定，粉碎成粗粉。
5. 结果处理与分析
采用统计软件 SPSS，对试验结果（总皂苷含量）进行多元逐步回归分析： Y= 56.777 + 1.508*X2 - 5.726*X3 + 0.019*X4
影响因素显著水平：P（X2）=0.070；P（X3）=0.010；P（X4）=0.482
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1 本课题得到国家高技术研究发展计划（863 计划）的资助（项目编号：2002AA2Z3204） -1-
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调温电热套（北京市永光明医疗仪器厂）；JJ-1 精密增力电动搅拌器（江苏金坛市恒丰仪 器厂）。
试剂：乙醇、正丁醇、氢氧化钠、盐酸、香草醛、高氯酸、冰醋酸等试剂均为分析纯。 对照品：黄芪甲苷对照品（中国药品生物制品检定所提供；供含量测定用，批号为 0781-200210）。
次，分取正丁醇液；加水 200ml，动态洗涤 1 次，分取正丁醇液；加水 200ml，动态洗涤 1
次并调节溶液 pH 至中性，分取正丁醇液；减压回收溶剂，所得流浸膏加丙酮研磨洗涤至丙
酮液色浅，垂熔玻砂漏斗滤过，取沉淀挥干溶剂，干燥，粉碎成细粉。
精密称取一定量上述细粉，依法测定总皂苷含量。
表 2 黄芪总皂苷纯化工艺试验安排和结果表
为 200ml，固定动态萃取的搅拌速度，动态萃取时间为每次 15 分钟，碱洗浓度与碱化浓度
相同，在此条件下，影响萃取工艺的主要因素：药液浓度（以每 200ml 药液中含原生药量计
算）、氢氧化钠用量、正丁醇萃取次数、正丁醇萃取用量。
采用均匀设计试验设计安排试验，采用混合水平的均匀设计表 U8（8×43）[9]安排因素
6. 验证试验与结果
按黄芪总皂苷的纯化工艺进行验证试验，在测定总皂苷含量的基础上，按中国药典 2005
年版一部黄芪项下含量测定方法测定黄芪甲苷的含量（HPLC-ELSD 方法）[1]。
表 4 黄芪总皂苷纯化工艺验证试验结果
序号 黄芪总皂苷收率（占药材，%） 黄芪甲苷含量（占浸膏，%） 黄芪总皂苷含量（占浸膏，%）
560nm
图 1 黄芪甲苷对照品溶液显色后可见光扫描图谱
标准曲线的制备：精密量取对照品溶液 0.0、1.3、1.6、1.9、2.2、2.5、2.8ml，分别 置具塞磨口试管中，置水浴中加热，蒸干溶剂，加 5%的香草醛-冰醋酸 0.2ml，加高氯酸 0.8ml， 密塞，置 70℃水浴恒温加热 20 分钟，取出，立即用冰水冷却，加冰醋酸 5.0ml 摇匀；以相 应的溶液为空白。
参考文献
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典 2005 年版一部[M].北京：化学工业出版社.2005：212～213 [2]万德光，彭成，赵军宁.四川道地中药材志[M].成都：四川出版集团·四川科学技术出版社.2005：492～ 495 [3]陈晓宁.黄芪总皂苷的药理研究[J].数理医药学杂志.2005，18（6）：602～603 [4]江燕，晁若冰.黄芪药材中黄芪甲苷和总皂苷含量的比较[J].华西药学杂志.2007，（7）：322～324 [5]唐金海，余东升，潘立群.UV 法测定黄芪注射液浓缩液微乳中黄芪总皂苷含量的实验研究[J].中华中医 药学刊.2007，25（10）：2033～2034 [6]李永吉，管庆霞，关延彬.HPLC 与比色法测定复方黄芪注射液中总皂苷与黄芪甲苷含量[J].黑龙江医 药.2004，17（1）：1～3 [7]潘细贵，汪洋，雷湘，等.大孔吸附树脂纯化黄芪总皂苷的提取工艺研究[J].中国医院药学杂志.2005， 25（11）：1029～1031 [8] 余 祖 兵 ， 杨 永 安 ， 张 喜 全 ， 等 . 黄 芪 甲 甙 组 合 物 及 其 制 备 方 法 [P]. 申 请 号 02137982.3. 公 开 号 CN1470241A.2002-7-22 [9]方开泰.均匀设计与均匀设计表[M].北京：科学出版社.1994：149 [10]李伟东，贾晓斌，蔡宝昌.黄芪总皂苷提取工艺研究[J].成都中医药大学学报.2004，27（2）：43～45
1
0.36
6.42
65.23
2
0.37
6.11
62.85
3
0.35
6.56
67.94
平均
0.36
6.36
65.23
验证试验结果表明，黄芪总皂苷纯化工艺稳定、可行。
7. 讨论
黄芪总皂苷的纯化方法较多，其中大孔吸附树脂方法近年来在专利、文献中时有报道， 但大孔吸附树脂尚无药用树脂标准，在应用中存在树脂吸附容量低、树脂吸附容量下降快、 洗脱用乙醇消耗大、低浓度乙醇回收难度大等缺陷，严重影响了大孔吸附树脂在医药中间体 制备和中药有效部位的分离纯化中的应用。
回归方程显著水平：P=0.010，回归方程有统计学意义。 回归方程预测 Y 值取得最高指标时各个因素组合： 氢氧化钠用量 X2=10g，正丁醇萃取次数 X3=2 次，正丁醇萃取用量 X4=250ml；预测总皂 苷含量 Y=65.155%，预测值高于均匀设计各组的结果。 回归方程中未引入的因素为药液浓度 X1，说明药液浓度对总皂苷的含量影响较小，根据 试验中直观分析，药液浓度在 200g/200ml 时，萃取液黏度较小，故药液浓度确定为 1g/ml。 根据均匀设计试验结果，确定黄芪总皂苷的纯化工艺为： 取黄芪粗粉，按优化提取工艺，浓缩至每 1ml 含原生药 1g，加入氢氧化钠（用量为 5%）， 搅拌使溶解；加入水饱和正丁醇动态萃取 2 次，溶剂用量为每次 1.25 倍量，分取正丁醇液； 加 5%氢氧化钠溶液 1 倍量，动态洗涤 1 次，分取正丁醇液；加水 1 倍量，动态洗涤 1 次， 分取正丁醇液；加水 1 倍量，动态洗涤 1 次并调节溶液 pH 至中性，分取正丁醇液；减压回 收溶剂，加丙酮研磨提取至丙酮液无色，取沉淀挥干溶剂，减压干燥，粉碎成细粉，即得。