第三章-载体与宿主的选择

载体应具备的条件
具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性） 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点 具有较高的外源DNA的载装能力 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点 具有合适的筛选标记
2 质粒
2.1 质粒的定义
质粒（Plasmid）：细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分子，能稳 定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。 现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的，常含抗生素抗性基因， 是重组DNA技术中重要的工具。
值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒的存在和协助 下，也能发生DNA转移，这个过程由 bom 和mob 基因决定.
在一般情况下，质粒的接合转移能力与分子大小及复制型间有一定的相关 性。现归纳如下：
接合型质粒 分子量大 严紧型复制
非接合型质粒 分子量小 松弛型复制
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2.2.4 携带特殊的遗传标记
2. Rep蛋白质是一种具有双重功能的蛋白质。 它既具有自体阻遏蛋白质的功能，可同P/O区结合
而抑制转录作用；同时又具有起始蛋白质的功能 ，能对复制起点（ori）发生作用，引发质粒DNA 进行复制[图（b）]
2.2.2 质粒的不相容性
任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞 中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质粒组成不相容性群 。 以大肠杆菌的质粒为例：
第三章 基因工程载体及宿主
第一节 用于基因克隆的载体
载体的功能及特征 质粒（plasmid） 噬菌体或病毒DNA 考斯质粒（cosmid）与噬菌粒 人造染色体载体 真核细胞的克隆载体
载体的功能
1 载体的功能及特征
运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件
野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主 生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：
物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物 物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱 这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义
质粒广泛存在于细菌细胞中，在霉菌、蓝藻、酵母和一些动植物细胞中也发
现了质粒。
绝大多数的质粒是DNA型的，少量线型或RNA质粒。 绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA （covalently closed circular DNA）
质粒DNA的分子量范围：1 - 300 kb
2.2.1质粒的自主复制性
质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制 质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系 根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型 ：
严紧型复制控制的质粒 1 - 3 拷贝 （stringent plasmid） 松弛型复制控制的质粒 10 - 60 拷贝 （relaxed plasmid） 不同类型质粒其本质是是否受宿主细胞不稳定的复制起始蛋白控制。
（1）抑制蛋白质稀释模型 它认为质粒DNA的复制，
是受一种由质粒DNA编码的抑 制蛋白质Cop调控的。细胞中 Cop蛋白质的浓度是同质粒分 子的拷贝数成正比，它抑制质 粒DNA复制活性的作用方式有 两种途径：一种是通过同质粒 DNA的复制起点（oir）结合， 直接地抑制质粒DNA的复制； 另一种是通过阻断起始蛋白质 Rep的合成，间接地抑制质粒 DNA的合成。
两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系 统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多的质粒在以后 的细胞分裂周期中更具优势。
2.2.3 质粒的可转移性
革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类： 接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细 胞（接合作用），如F、Col、R质粒等 非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用如Col、R 的其它成员
即使是同一质粒，其拷贝数在不同的寄主细胞间和不同的生长环境也可 能有很大的变化。
目前公认的用于阐释质粒DNA复制控制机理的分子模型有两种：其一 是自体阻遏蛋白质模型（autorepressor model），其二是抑制蛋白质稀释 模型（inhibitor dilution model）。前者的核心内容是，阻遏蛋白质的合成 受负反馈（negative feedback）机理调节，而且其浓度是恒定的。后者的关 键论点是，阻遏蛋白质是组成型合成，其浓度同质粒的拷贝数成正比。
（2）自体阻遏蛋白质模型
在抑制蛋白质稀释模型提出若干年之后， L.Sompayrac和O.Maaloe也提出了另外一种解释 质粒DNA复制机理的自体阻遏蛋白质模型。
这个模型对质粒DNA复制控制机理有两种解 释：
1.质粒DNA的复制是由一种叫做起始蛋白质 Rep引发的。Rep蛋白质编码基因rep和自体阻遏 蛋白质编码基因atr是属于同一个操纵子，它们共 转录成同一个mRNA分子。自体阻遏蛋白质通过 同启劝子-操纵基因区（P/O）的结合作用，调节 质粒DNA的转录作用，以维持细胞中Arr和Rep蛋 白质处于恒定的水平。而后，由Atr蛋白质调节产 生的Rep蛋白质，则是通过同复制起点（ori）的 结合，来引发质粒DNA的复制[图（a）]。
双螺旋共价闭合环 （SC构型）
开环双螺旋 （OC构型）
线状双螺旋 （L构型）
大肠杆菌的质粒主要有F质粒（大肠杆菌致育因子）、 Col质 粒（大肠杆菌素因子）、 R质粒（抗药性因子）、降解质粒 等。 隐蔽性质粒 多表型质粒
2.2 质粒的基本特征
质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗 传的一类核酸分子。
ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容
质粒的不相容性：分子机制 两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系 统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期和 细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内。