微球偶联论文3

几种高分子微球与兔免疫球蛋白的偶联及偶联条件的优化

易建科1李培武2张文2刘红海 1 李顺意1

(1. 湖北大学生命科学学院，武汉 430062

2. 中国农科院油料作物研究所武汉430062)

摘要:利用化学偶联法，将八种不同性质的高分子微球与自制的兔免疫球蛋白偶联,根据偶联量大小，考虑微球的性价比，选择出合适的高分子微球产品。实验对200目的氨基硅胶微球的偶联条件作进一步摸索。结果表明，当偶联时间6-8h，EDC量10mg/mL，蛋白质初始浓度为0.7mg/mL时。兔免疫球蛋白的偶联率达到80%，黄曲酶毒素B1 的柱回收率在90%以上,达到放大生产要求。

关键词:高分子微球,免疫球蛋白,偶联,黄曲酶毒素B1

中国分类号：Q987 文献标识码：A

亲和层析因为其在纯化特异性和精度上的优点，多应用于各种特异物质的分离和纯化。针对黄曲酶毒素、覆马毒素、赭曲毒素等生物小分子的亲和层析柱在国际上已经商品化［1］，而在国内，大规模制备针对黄曲酶毒素的亲和层析柱还未能实现。亲和层析柱制备中重要的一个环节是亲和介质的固定化，一般多运用化学结合法将免疫球蛋白（Ig）以共价键的方式偶联到固相载体上，这些能偶联各种目标蛋白的载体被称为高分子微球［2］。本试验选用了北京卓冠公司在2005年7月出厂的一批高分子微球产品和武汉大学化学和分子科学学院研制的高分子微球作为材料，对各种高分子微球与自制的兔Ig的偶联条件作了初步探索，为黄曲霉毒素B1（AFB1）免疫亲和柱的批量生产及其在农产品质量安全检测工作中的广泛运用奠定了基础。

1 材料与方法

1．1 实验仪器及试剂

DJ-1自动搅拌器(金坛市大地自动化仪器厂)；Pharmacin Biotech恒温冷浴装置；UNICAM UV500紫外-可见分光光度计；METTLER AE240分析天平；Sigma 2k15 高速冷冻离心机。 HITACHI f-4500 荧光分光光度计；真空泵（Agilent 公司生产）。

分析纯碳二亚胺（1-乙基－3-（3-二甲氨基丙基））（EDC），色谱纯甲醇，分析纯AFB1，AFB1荧光增强剂（自制），Ig溶液（AFB1的兔多抗纯化而得，Ig 纯度90%左右，ELISA效价1∶8000以上，自制）。氨基和羧基类微球,包括环氧琼脂糖微球干粉、氨基琼脂糖稀溶液、半干COOH-resin HPFF、半干NH2-resin HPFF（以上均为北京卓冠公司生产）以及100目氨基硅胶微球干粉和200目氨基硅胶微球干粉（均为武汉大学化学与分子科学学院提供）。环氧琼脂糖微球干粉，CNBr-activated resin FF干粉，Aldehyde-resin HPFF干粉（均为北京卓冠公司生产）。

1.2 实验方法

1.2.1 偶联实验方法

将适量氨基和羧基类微球置于4℃冷浴回流杯，加入用6mmol/L 磷酸缓冲液（PB ）按6：1稀释的Ig 溶液，调pH 到5.0,开启自动搅拌器，加入EDC 。达到要求的反应时间后，停止反应（环氧琼脂糖、CNBr-activated resin FF 和Aldehyde-resin HPFF 微球偶联时用0.25mol/L 的碳酸盐缓冲液稀释，调pH 到8.0，不加EDC ）。固相微球与蛋白质偶联时，容易发生非共价吸附，反应结束后，应用PB 多次冲洗微球，减少非共价吸附。各组实验均设重复一次，反应结束后，取少量反应后溶液于冷冻离心机上4℃、3000g/转离心5分钟，在此转速度下，Ig 溶液不会沉降，而固体大颗粒沉淀下来。将上清于紫外分光光度计上测量溶液中蛋白质在260nm 和280nm 的吸光值，计算出偶联前后的蛋白质浓度，从而得出偶联量。蛋白质浓度的计算采用如下公式［3-4］：

C=1.45A 280-0.74A 260

其中C 为蛋白质浓度。A 280为溶液在280nm 波长的吸光值，A 260为溶液在260nm 波长的吸光值。

微球形态上有稀溶液、半干和干粉之分，需将偶联量的大小换算成干粉状态下的蛋白质偶联量。干粉类微球的膨胀率约为3.5mL/g,半干类约为2mL/g 。换算公式为：

蛋白质相对偶联量= 微球量

膨胀率绝对偶联量 1.2.2 200氨基硅胶微球偶联的优化方法

Ig 的与微球的偶联与多种因素有关，偶联时间、EDC 用量、缓冲液pH 以及实验温度都对偶联有影响。Ig 在极端pH 和高温下容易变性，且根据微球性质，实验将缓冲液pH 控制在5左右，温度控制在4℃。为优化EDC 用量和偶联时间，设置实验如下，根据EDC 量的不同，分为一，二，三，四组。设重复一次。实验时将Ig 加入到6mmol/L PB 中，使其最终浓度为7mg/mL 。接着加入1g 200目氨基硅胶微球，于4℃下搅拌。加入不同浓度的EDC ，使其浓度分别为5mg/mL ，6mg/mL ，7mg/mL 和8mg/mL 。分别在反应进行到6，8，10，12，16，20h 时取样，并测定蛋白质浓度。确定各组别偶联量最大反应时间段后，再设置实验，在反应时间达到最大偶联量时间段时将偶联后的微球装柱，做柱容量实验。平衡液为0.1mol/L PB ，上样时加入4ng/mL 的AFB1的20%甲纯水溶液5mL ，然后用3mL 0.1mol/L PB 淋洗，用1mL 色谱纯甲醇洗脱。在1mL 回收液中加入1mL 双蒸水，加入200mL 荧光增强剂，于F-4500荧光分光光度计上测定溶液中AFB1的含量。计算公式（经验公式）为：

C=(X 2－0.9*X 1)/5.74

C为1mL回收液中AFB1的含量。X1为初始荧光值，X2为荧光增强值。

2结果

2.1 八种不同高分子微球与Ig的偶联

按照方法1.2.1,八组实验后，取二次重复的平均值。结果如表2 所示。以

氨基和羧基为偶联活性基团的高分子微球偶联效果较其它三类的好。半干

NH2-resin FF微球的偶联量可达6.6mg蛋白质/g微球。200目氨基硅胶微球干

粉的偶联量约4.8mg/g左右。而其它三类的高分子微球蛋白偶联量都较低，CNBr

活化的和环氧的以及带聚醛基的高分子微球蛋白质偶联量均在1mg/g左右。在微

球的筛目大小对偶联量影响比较中，200目氨基硅胶微球比100目氨基硅胶微球

偶联量大。而且200目氨基硅胶微球的价格比较低廉，综合考虑，选择了200

目氨基硅胶微球作为了下一步研究的亲和层析基质。

表2 高分子微球与Ig的偶联结果

类别蛋白初始量/mg 微球量/mL(g) 绝对偶联量/mg 相对偶联量/mg/g 氨基琼脂糖 6.1 4 2.8 2.5

半干COOH-resin 6.0 1.5 2.6 3.7

半干NH2-resin 6.0 1 3.3 6.6

100目氨基硅胶 8.0 (1.0) 3.8 3.8

200目氨基硅胶 4.0 (0.5) 2.4 4.8

环氧琼脂糖 6.9 (2.0) 1.2 0.6 Aldehyde-resin 6.0 (0.5) 0.6 1.2 CNBr-activated 6.0 (0.5) 0.8 1.6

2.2 200目氨基硅胶微球偶联条件优化结果

根据方法1.2.2，四组实验后，实验结果如图1所示。各组别中，第一、二

组在13h左右时反应达到最大值；第三组在9h左右达最大值；第四组在8h左右。第四组最大偶联量达6.8mg/mL,在四组中偶联量最高。在柱回收率检测实验中，

各组截获AFB1值分别如表3所示。当EDC浓度不超过7mg/mL时，柱回收率随着

蛋白质偶联量的增加而增加。EDC浓度为7mg/mL时，柱回收率达到最高，为96.3%。而当EDC浓度达8mg/mL时，虽然微球与Ig的偶联量最大，柱回收率却急速下降。

图1 200目氨基硅胶微球与Ig的偶联结果