基因克隆PPT演示文稿

Herbert Boyer
Stanley N. Cohen 12
“工程鲫”、“工程 鲤”
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多 利 和 它 的 孩 子
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沃 尔 小 组 成 功 克 隆 两 只 恒 河
猴 16
吴明杰小组：5只克 隆猪
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第二节 重要的工具酶
限制性核酸内切酶； DNA聚合酶； DNA连接酶； T4多核苷酸激酶； 碱性磷酸酶。
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识别4个碱基 识别6个碱基 识别8个碱基
1/44=1/256 1/46=1/4096 1/48=1/65536
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5‘ GAATTC 3’ 3’ CTTAAC 5’
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RE recognition/cleavage site are palindromic DNA sequences, not palidromic as in “ABBA”.
E.x. EcoRⅠ 5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5'
Ⅱ型酶有严格的识别、切割顺 序 ， 以 内 切 方 式 水 解 双 链 DNA 中 的 磷 酸 二 酯 键 ， 产 生 的 DNA 片段5’端为P，3’端为OH。
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识别顺序一般为4—6个碱基，通常是反 转重复顺序，具有180°的旋转对称性,也称 回文结构，palindrome,具有对称结构的 DNA片段。一条链上的碱基顺序（例如从 5‘3’）和另一条链上从5‘ 3’的顺 序完全相同。例如，
These sites are DNA sequence that are identical on both DNA strands.
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Q: Which of the following 2 DNA sequences is a potentional RE recognition site?
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一、Restriction Endonucleases 1 定义
限制性核酸内切酶（限制酶），是 一类能识别和切割双链DNA分子内特 定碱基顺序的核酸水解酶。
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Restriction Endonucleases
Made by bacteria and viruses. Over 500 Restriction endonucleases exist. These will cleave over 80 specific sequences.
Ex. EcoRⅠ GAATT C
C TTAAG
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Agarose Gel Electrophoresis
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3 命名原则
H ． O ． Smith 和 D．Nathams(1973)提议的命名系统 已被公众所接受，其命名原则如下：
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• 限制酶第一个字母(大写，斜体)代表该酶的微 生物(寄主菌)属名；第2、3个字母(小写，斜体) 代表微生物种名。
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三、意义
重组DNA技术填平了生物种属间不可逾越 的鸿沟； 重组DNA技术缩短了进化时间； 重组DNA技术使人能对生物进行定向改造。
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基因工程大事记
1973 Cohen第一例成功的克隆实验 1978 Genentech公司 人胰岛素 世界上 第一种基因工程蛋白药物 1982 第一个基因工程药物--重组人胰岛素 在英、美获准使用 1985 第一批转基因家畜（兔、猪和羊）， 中国 转基因鱼
• 接下来的字母代表寄主菌的株或型。 • 如果从一种菌株中发现了几种限制酶，则根据
发现和分离的顺序用罗马字母表示。
从大肠杆菌（E.coli）R菌株分离到的几种限
制酶，分别表示为EcoRⅠ、 EcoRⅡ 、 EcoRⅤ等。
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Restriction Endonuclease Enzymes
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4 Ⅱ型酶作用特点
基因工程及体外表达体 系（1）.酶
心血管病研究所 王佐
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基因工程及体外表达体系
酶 载体 方法
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第一节 概述
定义 基本步骤 意义
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定义：应用酶学的方法，在体外将目的 基因与载体DNA结合成一具有自 我复制能力的DNA分子（复制 子、重组体），继而通过转化或 转染宿主细胞、筛选出含有目的 基因的转化子细胞，再进行扩 增、提取获得大量同一DNA分子 拷贝，或其表达产物。
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2 分类
限制酶可分为3型。
➢I型和Ⅲ型限制酶同时具有限制与修 饰两种功能; ➢I型限制酶没有固定的切割位点，随 机切割产生非专一切口；
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➢ Ⅲ型限制酶在DNA链上有特异切割位点， 但其切割位点在识别位点以外。
I型和Ⅲ型限制酶在分子克隆中用途 不大。通常所指的限制酶是Ⅱ型酶。
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Ⅱ型酶对DNA水解有很强的特异性， 它要求严格的顺序作为切割点。切点顺 序中有一个碱基的变异、缺失或修饰， 便不再被水解，因此在分子克隆中常用， 它被誉为分子生物学家的手术刀。
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Recombinant DNA technology Gene cloning Molecular cloning Gene engineering Genetic engineering
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二、基本步骤
目的基因的获得； 目的基因与载体的连接； 重组DNA分子导入受体细胞； 筛选出含重组DNA分子的受体细胞克隆； 克隆基因的表达及表达产物的检测和分离 纯化。
Leabharlann Baidu
1993 基因工程西红柿在美国上市 1997 英国罗斯林研究所 多莉羊 1999.9 中国获准加入人类基因组计划.
负责测定人类基因组全部序列的1% 2000.6.26科学家公布人类基因组工作草图 2001.2.11 公布人类基因组基本信息 生物技术工程：基因工程、蛋白质工程、 酶工程、细胞工程、干细胞
Ⅰ. 5’ AGTTGA 3’ Ⅱ. 5’ GCACGTGC 3’ Q: If show below is ½ of a RE site, what is the DNA
sequence for the remaining ½? 5’ TCA _ _ _ 3’
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从理论上讲，如果DNA链上的A、T、 C和G四种碱基随机分布，根据限制酶 识别碱基的个数可估算限制酶的切割几 率 ， 同 时 也 决 定 了 它 切 割 DNA 后 产 生 的DNA片段的长度。实际上，限制酶 对DNA的切割是“全”或“无”。