基因克隆PPT演示文稿
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基因的克隆方法ppt课件
1）直接从基因组中扩增过程： （1）提取基因组DNA作模板 （2）根据目的基因序列设计引物 （3）PCR扩增及产物鉴定
31
提取基因组DNA
PCR引物设计
PCR扩增
基因序列分析
此法适合扩增原 核生物基因。
真核生物基因组含有内含子32 ！
2）从mRNA中扩增: RT-PCR
（1）提取基因组 total RNA （2）反转录合成总cDNA作模板 （3）根据目的基因序列设计引物 （4）PCR扩增及序列分析
工作量大。 无法定量研究。 扩出的条带往往是3`端比较短的UTR区的一
段序列，提供的信息较少。
19
优点：
简便、灵敏、高效、省时，能快速显示 mRNA的组成。
所需的mRNA量少。 各样本mRNA的差异可同时进加标签的基因克隆 方法野生株构建基因组 基因苗构建基因组文 库基因苗
阳性克隆
获得阳性克隆 目的基因
基因序列分析，24 确定为基因
转座子标签法
转座子又称转座因子或者跳跃因子，实 际上也是DNA片段，它可以在生物的染色 体组中移动，从染色体的一个位点跳到另 一个位点，或从一条染色体跳到另一条染 色体上，引起基因功能的改变。
mRNA
5` RP
A T C G
AAAAAAAA
A C
TTTTTTTTTT
G
3`
15
mRNA
5` RP
A T C G
AAAAAAAA
A C
TTTTTTTTTT
G
3`
AATTTTTTTT ACTTTTTTTT AGTTTTTTTT TATTTTTTTT
TCTTTTTTTT TGTTTTTTTT CATTTTTTTT CCTTTTTTTT CGTTTTTTTT GATTTTTTTT
31
提取基因组DNA
PCR引物设计
PCR扩增
基因序列分析
此法适合扩增原 核生物基因。
真核生物基因组含有内含子32 ！
2）从mRNA中扩增: RT-PCR
（1）提取基因组 total RNA （2）反转录合成总cDNA作模板 （3）根据目的基因序列设计引物 （4）PCR扩增及序列分析
工作量大。 无法定量研究。 扩出的条带往往是3`端比较短的UTR区的一
段序列，提供的信息较少。
19
优点：
简便、灵敏、高效、省时，能快速显示 mRNA的组成。
所需的mRNA量少。 各样本mRNA的差异可同时进加标签的基因克隆 方法野生株构建基因组 基因苗构建基因组文 库基因苗
阳性克隆
获得阳性克隆 目的基因
基因序列分析，24 确定为基因
转座子标签法
转座子又称转座因子或者跳跃因子，实 际上也是DNA片段，它可以在生物的染色 体组中移动，从染色体的一个位点跳到另 一个位点，或从一条染色体跳到另一条染 色体上，引起基因功能的改变。
mRNA
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分子生物学实验技术ppt课件
质粒转化大肠杆菌的过程
感受态
非定向克隆 +
或
定向克隆
克隆的片段只能按
+ 特定方向连接基因组DNA的构建基因组DNA的类型
质粒（﹤10kb)噬菌体质经双向电泳之后，用蛋白质水解酶裂解成肽段，可 用于质谱分析。通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子， 然后用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比 值（M/Z值）的蛋白离子分离开，经过离子检测器收集分离 的离子，确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白质。
两种离子发生方法： 基质辅助激光解吸附/离子化（MALDI)、电喷雾离子化 （ESI)
噬菌体展示技术
噬菌体展示技术是将编码目的蛋白的基 因与编码噬菌体表面蛋白的基因融合后， 以融合蛋白的形式表达在噬菌体表面的一 种技术。
将不同蛋白的cDNA插入噬菌体载体进 行表达，得到表达不同蛋白的一定规模的 噬菌体展示库 。
将“诱饵”蛋白固定化，基于“诱饵”蛋白与 “猎物”蛋白之间的相互作用，可将展示库 中与固定化的“诱饵”蛋白有相互作用的“猎 物”蛋白分离纯化出来，再对“猎物”蛋白进 行质谱鉴定。
四、蛋白组学研究
蛋白质分离 蛋白质分析 蛋白质相互作用的研究方法： 酵母双杂交技术，噬菌体展示技术，表
面等离子共振技术，荧光共振能量转移 技术，蛋白质微阵列芯片技术，免疫共 沉淀技术，pull-down技术
蛋白质分离
最常用的蛋白质分离技术是20世纪70年代发明的双 向电泳（2-DE），是根据蛋白质的等电点不同在pH 梯度介质中进行第一次分离，即等点聚焦（IEF)，然 后根据蛋白质分子量的不同进行第二次分离，即 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
重叠延伸PCR原理
重叠延伸PCR技术由于使用了具有互补末端的引物， 使PCR 产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过 重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。可 简单迅速的将两个DNA片段连在一起，用于嵌合基因的构 建
基因的克隆与表达PPT课件
2．真核表达系统：使外源基因在真核细 胞中表达的体系。
.
32
二．原核生物基因结构和表达特点
.
33
1. 原核生物染色体DNA是裸露的环形 DNA，其转录和翻译是偶联的连续 进行。
2. 原核生物形成多顺反子mRNA： mRNA在合成过程中和多个核糖体 结合，翻译形成多条肽链。
.
34
3、一般不含内含子（intron），没有转 录及翻译后加工系统
• PCR过程中，普通的Taq酶可在产 物的3’端多加一个A
.
17
五、基因克隆的工作流程
（一）目的基因的获得
1、直接分离3、构建cDNA4、PCR5、人工合成
6、差异显示
.
18
1、直接物的基因组DNA切割成一定大 小的片段，并与合适的载体重组后 导入宿主细胞，进行克隆。这些存 在于所有重组
11
三、受体细胞
1、定义：外源DNA导入的细胞，是 重组体扩增的场所。
2、要求：易于接纳外源DNA
无特异的内源性核酸内切酶
载体复制、扩增不受阻
与载体有互补性
.
12
四、体外重组的策略
1、粘末端连接 1）全同源粘末端连接 • 最方便简单 • 高背景-载体自身环化 • 双向插入
.
13
2）定向克隆：使外源基因定向插入到载体 中的克隆策略
基因的克隆与表达
.
1
➢基因克隆(gene cloning) ➢基因表达(gene expression)
-原核基因表达 -真核基因表达
.
2
基因克 隆 Gene Cloning
.
3
➢概述 ➢克隆载体 ➢受体细胞 ➢体外重组的策略 ➢基因克隆工作流程
.
32
二．原核生物基因结构和表达特点
.
33
1. 原核生物染色体DNA是裸露的环形 DNA，其转录和翻译是偶联的连续 进行。
2. 原核生物形成多顺反子mRNA： mRNA在合成过程中和多个核糖体 结合，翻译形成多条肽链。
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3、一般不含内含子（intron），没有转 录及翻译后加工系统
• PCR过程中，普通的Taq酶可在产 物的3’端多加一个A
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五、基因克隆的工作流程
（一）目的基因的获得
1、直接分离3、构建cDNA4、PCR5、人工合成
6、差异显示
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1、直接物的基因组DNA切割成一定大 小的片段，并与合适的载体重组后 导入宿主细胞，进行克隆。这些存 在于所有重组
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三、受体细胞
1、定义：外源DNA导入的细胞，是 重组体扩增的场所。
2、要求：易于接纳外源DNA
无特异的内源性核酸内切酶
载体复制、扩增不受阻
与载体有互补性
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四、体外重组的策略
1、粘末端连接 1）全同源粘末端连接 • 最方便简单 • 高背景-载体自身环化 • 双向插入
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2）定向克隆：使外源基因定向插入到载体 中的克隆策略
基因的克隆与表达
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1
➢基因克隆(gene cloning) ➢基因表达(gene expression)
-原核基因表达 -真核基因表达
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基因克 隆 Gene Cloning
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3
➢概述 ➢克隆载体 ➢受体细胞 ➢体外重组的策略 ➢基因克隆工作流程
In-fusion技术.ppt
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• 1、Genius only means hard-working all one's life. (Mendeleyer, Russian Chemist) 天才只意味着终身不懈的努力。20.8.58.5.202011:0311:03:10Aug-2011:03
• 2、Our destiny offers not only the cup of despair, but the chalice of opportunity. (Richard Nixon, American President )命运给予我们的不是失望之酒，而是机会之杯。二〇二〇年八月五日2020年8月5 日星期三
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August 19, 2020
•
In-Fusion®基因克隆技术原理示意图
50 ℃，15 min单管反应
In-Fusion专利酶
In-Fusion是一种快速、简单、高效的基因克隆技术！
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•
主要内容
1 In-Fusion®克隆技术的原理 2 In-Fusion®优点及应用实例 3 In-Fusion®系列产品介绍 4 常见问答
• 10、Life is measured by thought and action, not by time. ——Lubbock 衡量生命的尺度是思想和行为，而不是时间。8.5.20208.5.202011:0311:0311:03:1011:03:10
• 11、To make a lasting marriage we have to overcome self-centeredness.要使婚姻长久，就需克服自我中心意识。Wednesday, August 5, 2020August 20Wednesday, August 5, 20208/5/2020
基因的图位克隆ppt课件
• G. Zhang et al等利用IR24和IRBB13杂交，得到的F2分离群体，利用BSA法，找 到了一个RAPD标记OPAC05，在抗病池和感病池之间有多态性。从而将 xa13定 位于OPAC05附近。
•
G. Zhang et al. 1996 , Theor Appl Genet 93:65 70
常发挥。
优点：目的明确，对由基因家族控制的相关形状，抑制表达能同 时降低此基因家族成员的功能；抑制表达和超表达是研究时空表 达的有力工具。
缺点：抑制表达和超表达会使相关基因的功能紊乱，常常很难判 断相关表型的改变是由于目标基因还是由于被紊乱的基因引起的。
葛莘. 高级植物分子生物学, 2004
•另外还有TILLING技术、芯片技术、比较基因组学、生物信息学……都被广泛的应 用于基因的克隆。
如果在xa13两侧都检测到有来自IR24的标记基因型， 则这个两个标记就是基因xa13的边界。
后来储朝晖博士，为了验证以上的结果，利用极端隐性分组分析法对来自IRBB13 和IR24杂交的250株极端抗病F2单株把 xa13 重新定位于S14003和RG163之间，同时 一个新发现的CAPS 标记E6a定位于标记RG136和xa13基因之间，从而以Ea6和 S14003作为构建物理图谱的起点。
• 3. 图位克隆和以 xa13为例介绍图位克隆的详细过程
• 原理：在减数分裂︱时期，同源染色体之间配对，非姊妹染色单体发生交换，与目
标基因距离越远，发生交换的频率就越大，距离越近，发生交换的频率就越小（遗传 学第三定律）。（王亚馥，戴灼华. 遗传学.1999，第三章：60-76）与基因发生最小交 换频率的两侧分子标记，就是与基因最紧密连锁的分子标记，这两个分子标记之间的 区段就是包含这个基因的目标区段。
克隆基因的表达PPT课件
larger subunit attaches to the initiation complex. After the initiation phase the message gets longer during the elongation phase.
第19页，共56页。
New tRNAs bring their amino acids to the open binding site on the ribosome/mRNA complex, forming a peptide bond between the amino acids. The complex then shifts along the mRNA to the next triplet, opening the A site. The new tRNA enters at the A site. When the codon in the A site is a termination codon, a releasing factor binds to the site, stopping translation and releasing the ribosomal complex and mRNA. Often many ribosomes will read the same message, a structure known as a polysome forms. In this way a cell may rapidly make many proteins.
第18页，共56页。
Translation is the process of converting the mRNA codon sequences into an amino acid sequence. The initiator codon (AUG) codes for the amino acid N-formylmethionine (f-Met). No translation occurs without the AUG codon. f-Met is always the first amino acid in a polypeptide chain, although frequently it is removed after translation. The intitator tRNA/mRNA/small ribosomal unit is called the initiation complex. The
第19页，共56页。
New tRNAs bring their amino acids to the open binding site on the ribosome/mRNA complex, forming a peptide bond between the amino acids. The complex then shifts along the mRNA to the next triplet, opening the A site. The new tRNA enters at the A site. When the codon in the A site is a termination codon, a releasing factor binds to the site, stopping translation and releasing the ribosomal complex and mRNA. Often many ribosomes will read the same message, a structure known as a polysome forms. In this way a cell may rapidly make many proteins.
第18页，共56页。
Translation is the process of converting the mRNA codon sequences into an amino acid sequence. The initiator codon (AUG) codes for the amino acid N-formylmethionine (f-Met). No translation occurs without the AUG codon. f-Met is always the first amino acid in a polypeptide chain, although frequently it is removed after translation. The intitator tRNA/mRNA/small ribosomal unit is called the initiation complex. The
基因克隆简介ppt课件
5’3’-
5’3’-
GAATTC CTTAAG
G AATTC CTTAA G
-3’ -5’
-3’ -5’
14
（4）粘性末端的意义 ①连接便利
i）不同的DNA双链： 只要粘性末端碱基互补就可以连接。 这比连接两个平齐末端容易的多。
ii）同一个DNA分子内连接： 通过两个相同的粘性末端可以连接成环 形分子。
pBR322质粒
pBR322质粒是由三个不同来源的部分组成的：第 一部分来源于pSF2124质粒的氨苄青霉素抗性基 因（ampr）；
第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基因 （tetr）；
第三部分则来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA
复制起点（ori）。
27
PstI
ScaI
Ampr
HindIII BamHI
④ lacZ的a肽互补 1）a-肽（ lacZ’ ）：
b-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断 （11-41氨基酸），该段基因序列连接到 pUC载体上。
受体菌基因组的b-半乳糖苷酶基因的 缺失a肽（氨基端有缺失），不能形成 活性酶，不能分解Xgal
37
⑤ 载体lacZ’与a互补
pUC质粒载体上的lacZ’ 编码a肽与这个 缺失突变的b-半乳糖苷酶“互补”，又 能分解Xgal。产生蓝色物质。
15
16
2. DNA 连接酶 3.1 DNA连接酶（ligase)的发现
从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能 把两条DNA双链连接到一起的酶。
DNA复制一定有断口。 17
3.2 DNA ligase的特点
1. 两种DNA连接酶
（1）大肠杆菌连接酶 只能连接粘性末端。
（2）T4噬菌体的连接酶 不但能连接粘性末端， 还能连接齐平末端。
基因定位与克隆PPT课件
基因分布在24种染色体上，它们在染色体上的位置可通过两
种制图方法来表示：
1、物理图谱(physical map)，即确定基因之间的绝对物
理学距离，通常用Mb(百万碱基对)或Kb(千碱基对)来表示
2、遗传图谱(genetic map)，即确定基因之间的遗传学
距离，用cM(centimorgen分摩)表示。
编辑版ppt
NLM8 G
体细胞杂种法
• 体细胞杂种通常由人和鼠的体细胞融合而成。这些 融合细胞在最初几代培养过程中具有选择性丢失人 类染色体趋势，而保留所有的鼠染色体。
• 保留在融合细胞中的染色体可以是多条，也可能只 有一条甚至某条染色体的一部分。
• 根据研究的需要可将含有不同人类染色体的人鼠杂 种细胞组合成人鼠杂种细胞板(hybrid panel)，结 合杂种细胞板和PCR的方法或基因剂量分析，或蛋 白质表达分析，可将相应的基因定位到特定的染色 体或染色体片段上，该杂种细胞板在人类基因定位 以及人类基因组计划中发挥过重要的作用。
• 染色体多态法（chromosome heteromorphism） • 染色体畸变法(chromosome abnormality) • 体细胞杂种法(somatic cell hybrids) • 染色体分类法(chromosome sorting ) • 原位杂交法（FISH） • 剂量分析法(dosage ananlysis) • 测序法（sequencing） • 家系分析法 （pedigree ananlysis）
编辑版ppt
13
连锁分析原理
生殖细胞在减数分裂时发生交换，一对同源染色体 上存在着两两相邻的基因座位，若两者之间距离较 远，发生交换的机会较多，则出现重组次数就多； 若两者之间距离较近，则重组机会较少。
T-A基因克隆的技术要点.ppt
8）在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面。
Page ▪ 14
外源DNA的重组与转化
▪DNA的体外连接重组
▪ 其本质是一个酶促反应过程，即在一定的条件下，DNA连接酶 催化两个双链DNA片段的5’端磷酸和3’端羟基之间相互作用， 形成磷酸二酯键的过程。
▪ DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶 大肠杆菌DNA连接酶。
▪ lacZ 编码半乳糖苷酶的N端，它可以和宿主菌株产生的半乳糖苷酶C端互
补，形成有活性的β-半乳糖苷酶。
▪ Xgal 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷 ，β–半乳糖苷酶的底物，水解后呈
蓝色
▪ IPTG 异丙基硫代半21
蓝白斑
Page ▪ 22
T-A基因克隆的技术要点.ppt
Page ▪ 2
Page ▪ 3
3’-A突出的PCR产物
▪ 使用不同的Taq酶，在PCR扩增循环结束后，加上72℃10分钟 一个过程，Taq酶可以在扩增产物的3末端加上A 。
▪ 使用高保真的DNA聚合酶，如pfu酶，其不能在扩增产物的3 末端加上A，得到的DNA序列为钝端，因此，在回收纯化后进 行加A的过程，通常是以PCR回收产物为模板，加上一定量的 普通Taq酶和反应液，加入dATP（或dNTP）， 72℃ 10分钟 。
混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物黏附于细 胞表面，经42˚C短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物 。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化 过程中获得新的表型（如Amp+等）得到表达，然后将此细菌 培养物涂在含有氨苄青霉素的选择性培养基上进行培养获得阳 性克隆。
Page ▪ 17
▪ 如果使用ddTTP，效果会更好。
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外源DNA的重组与转化
▪DNA的体外连接重组
▪ 其本质是一个酶促反应过程，即在一定的条件下，DNA连接酶 催化两个双链DNA片段的5’端磷酸和3’端羟基之间相互作用， 形成磷酸二酯键的过程。
▪ DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶 大肠杆菌DNA连接酶。
▪ lacZ 编码半乳糖苷酶的N端，它可以和宿主菌株产生的半乳糖苷酶C端互
补，形成有活性的β-半乳糖苷酶。
▪ Xgal 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷 ，β–半乳糖苷酶的底物，水解后呈
蓝色
▪ IPTG 异丙基硫代半21
蓝白斑
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T-A基因克隆的技术要点.ppt
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3’-A突出的PCR产物
▪ 使用不同的Taq酶，在PCR扩增循环结束后，加上72℃10分钟 一个过程，Taq酶可以在扩增产物的3末端加上A 。
▪ 使用高保真的DNA聚合酶，如pfu酶，其不能在扩增产物的3 末端加上A，得到的DNA序列为钝端，因此，在回收纯化后进 行加A的过程，通常是以PCR回收产物为模板，加上一定量的 普通Taq酶和反应液，加入dATP（或dNTP）， 72℃ 10分钟 。
混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物黏附于细 胞表面，经42˚C短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物 。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化 过程中获得新的表型（如Amp+等）得到表达，然后将此细菌 培养物涂在含有氨苄青霉素的选择性培养基上进行培养获得阳 性克隆。
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▪ 如果使用ddTTP，效果会更好。
基因克隆PPT课件
（1）构建 由 pBR 质 粒 与 M13 噬 菌 体 构 建 成 的 双 链 DNA质粒载体，长2674bp，1983年构建。
.
14
主要特点：氨苄青霉素抗性基因、lac Z基因、
复制起始点（ori）
.
15
（2）筛选原理及方法
含 有 来 自 大 肠 杆 菌 的 lacZ 操 纵 子 的 DNA 片 段 （lacZ基因），编码β-半乳糖苷酶氨基端的一个片 段。此片段能与宿主细胞所编码的缺陷型β-半乳糖 苷酶实现基因内互补（α互补），形成完整的β-半乳 糖苷酶。该酶能分解X-gal，形成蓝色菌落。
基因工程及体外表达体系 （2）.载体
心血管病研究所 王佐
.
1
一、概述
外源DNA一般没有明显的遗传标志，如果 将其导入宿主细胞，没有有效的方法将导 入了外源DNA的细胞和未导入外源DNA的 细胞区分开来。
外源DNA导入宿主细胞后，不能随宿主细 胞的繁殖而复制，达不到使外源DNA片段 扩增的目的。
.
2
.
35
YAC载体序列包括着丝粒序列（CEN1）、端粒序列（TEL 使
线形DNA的完全复制和保护染色体末端免于核酸酶的降解）、
自主复制序列（ARS1 主导染色体DNA的自主复制）、氨苄青
霉素抗性基因（Amp）、源于E.coli的复制起始区（ori）。
.
36
由于酵母细胞内真正必需的DNA片段主要 限于几百碱基对，因而就可以用酵母染色体 复 制 子 ARS 元 件 构 建 新 型 的 克 隆 载 体 。
.
21
λ噬菌体载体在细菌中以溶菌状态生长。它有两种 形式：插入载体和替代载体。
DNA与λ噬菌体载体组成重组DNA分子后，还不能直接 转染宿主细胞，必须首先包装成有活性的成熟噬菌体颗粒 后才具有转染宿主细胞的能力，重组DNA分子能否被噬菌 体包装蛋白、头部所识别而被包装，除必须含有cos位点 外，就是对重组DNA分子长度有严格的限制，必须不能大 于野生型基因组长度的105％或小于75％，否则均不能被 包装成有活性的噬菌体颗粒，因此噬菌体载体大致允许插 入外源基因的长度范围为15～25kb。
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主要特点：氨苄青霉素抗性基因、lac Z基因、
复制起始点（ori）
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（2）筛选原理及方法
含 有 来 自 大 肠 杆 菌 的 lacZ 操 纵 子 的 DNA 片 段 （lacZ基因），编码β-半乳糖苷酶氨基端的一个片 段。此片段能与宿主细胞所编码的缺陷型β-半乳糖 苷酶实现基因内互补（α互补），形成完整的β-半乳 糖苷酶。该酶能分解X-gal，形成蓝色菌落。
基因工程及体外表达体系 （2）.载体
心血管病研究所 王佐
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1
一、概述
外源DNA一般没有明显的遗传标志，如果 将其导入宿主细胞，没有有效的方法将导 入了外源DNA的细胞和未导入外源DNA的 细胞区分开来。
外源DNA导入宿主细胞后，不能随宿主细 胞的繁殖而复制，达不到使外源DNA片段 扩增的目的。
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YAC载体序列包括着丝粒序列（CEN1）、端粒序列（TEL 使
线形DNA的完全复制和保护染色体末端免于核酸酶的降解）、
自主复制序列（ARS1 主导染色体DNA的自主复制）、氨苄青
霉素抗性基因（Amp）、源于E.coli的复制起始区（ori）。
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由于酵母细胞内真正必需的DNA片段主要 限于几百碱基对，因而就可以用酵母染色体 复 制 子 ARS 元 件 构 建 新 型 的 克 隆 载 体 。
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21
λ噬菌体载体在细菌中以溶菌状态生长。它有两种 形式：插入载体和替代载体。
DNA与λ噬菌体载体组成重组DNA分子后，还不能直接 转染宿主细胞，必须首先包装成有活性的成熟噬菌体颗粒 后才具有转染宿主细胞的能力，重组DNA分子能否被噬菌 体包装蛋白、头部所识别而被包装，除必须含有cos位点 外，就是对重组DNA分子长度有严格的限制，必须不能大 于野生型基因组长度的105％或小于75％，否则均不能被 包装成有活性的噬菌体颗粒，因此噬菌体载体大致允许插 入外源基因的长度范围为15～25kb。
基因克隆常用的方法PPT演示文稿
12
图３真核生物12种mRNA的序列特点
13
根据这12种mRNA序列可合成12种相应的反转录引物，即 M’N’TTTTTTTT……,用其分别进行反转录,即可将所有mRNA分类合成 12种cDNA(于12个试管内)，然后再用随机引物,以这12种cDNA分别做 模板进行PCR扩增(见图1和图4)，那么与表型相关的mRNA就很容易被 发现并克隆出来。但不论AP-PCR还是DD-PCR,都适用于2种种源近似生 物或不同发育阶段的同一个体之间的比较。因而,其PCR的模板必须是 来自2个生物或同一生物的不同发育阶段的mRNA。DD-PCR的优点是快 速、方便,可以检测表达量极低的mRNA，但其技术条件要求较高，所 扩增的mRNA的质量不能有差异,即mRNA不应降解。目前这一方法已广 泛应用于生物表型相关基因的克隆及比较研究。
2
目前,以Genbank的应用最频繁。这些基因库是相互联 系的,在Genbank注册的基因序列,也可能在Swissport注册。 要克隆某个基因可首先通过Internet查询一下该基因或相 关库中拿出来,根据整 个基因序列设计特异的引物,通过PCR从基因组中克隆该基 因，也可以通过RT-PCR克隆cDNA。值得注意的是,由于物 种和分离株之间的差异,为了保证PCR扩增的准确性,有必 要采用两步扩增法,即nested PCR。
基因克隆的几种常用方法
根据已知序列克隆基因 未知序列的基因打靶 根据已知探针克隆基因 用特异抗体克隆基因 特异基因的功能克隆
1
1、根据已知序列克隆基因
对已知序列的基因克隆是基因克隆方法中最为简便的一种。获取基因 序列多从文献中查取,即将别人报道的基因序列直接作为自己克隆的依据。 目前,世界上主要的基因库有: (1)EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室的基因库,
图３真核生物12种mRNA的序列特点
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根据这12种mRNA序列可合成12种相应的反转录引物，即 M’N’TTTTTTTT……,用其分别进行反转录,即可将所有mRNA分类合成 12种cDNA(于12个试管内)，然后再用随机引物,以这12种cDNA分别做 模板进行PCR扩增(见图1和图4)，那么与表型相关的mRNA就很容易被 发现并克隆出来。但不论AP-PCR还是DD-PCR,都适用于2种种源近似生 物或不同发育阶段的同一个体之间的比较。因而,其PCR的模板必须是 来自2个生物或同一生物的不同发育阶段的mRNA。DD-PCR的优点是快 速、方便,可以检测表达量极低的mRNA，但其技术条件要求较高，所 扩增的mRNA的质量不能有差异,即mRNA不应降解。目前这一方法已广 泛应用于生物表型相关基因的克隆及比较研究。
2
目前,以Genbank的应用最频繁。这些基因库是相互联 系的,在Genbank注册的基因序列,也可能在Swissport注册。 要克隆某个基因可首先通过Internet查询一下该基因或相 关库中拿出来,根据整 个基因序列设计特异的引物,通过PCR从基因组中克隆该基 因，也可以通过RT-PCR克隆cDNA。值得注意的是,由于物 种和分离株之间的差异,为了保证PCR扩增的准确性,有必 要采用两步扩增法,即nested PCR。
基因克隆的几种常用方法
根据已知序列克隆基因 未知序列的基因打靶 根据已知探针克隆基因 用特异抗体克隆基因 特异基因的功能克隆
1
1、根据已知序列克隆基因
对已知序列的基因克隆是基因克隆方法中最为简便的一种。获取基因 序列多从文献中查取,即将别人报道的基因序列直接作为自己克隆的依据。 目前,世界上主要的基因库有: (1)EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室的基因库,
基因的克隆PPT课件
载体的种类
质粒
1.大肠杆菌质粒 2.革兰氏阳性菌的质粒
噬菌体 真核细胞为宿主的克隆载体
1.酵母为宿主的载体 2.植物细胞为宿主的载体 3.DNA病毒载体
反转录病毒载体
大肠杆菌的质粒
pBR322质粒：它是由4361个核苷酸组成，属于松弛型质粒， 可以用抗氨苄西林和抗四环素基因作为标记，具有多种常用 内切酶的切点。
基因表达产物的鉴定
基因表达：指某基因在细胞中转录为mRNA继而翻译 成蛋白质的过程。
DNA
RNA
Protein
转录
翻译
研究基因表达的手段
1、RT-PCR (RNA) 2、Northern blot (RNA) 3、Western blot (蛋白质） 4、免疫组化 （蛋白质）
1、RT-PCR
基因的克隆 -----ＤＮＡ重组技术。
克隆：是用无性繁殖的方法产生一组遗传上相同的细 胞或生物群体的过程，而这些细胞或个体均来自无性 繁殖的单一原型细胞。
基因的克隆:用ＤＮＡ重组技术使一个基因或ＤＮＡ片 段产生出很多相同拷贝的过程。
基因克隆的技术路线的大体步骤
得出结论
步骤三： 步骤二： 步骤一：
多 克 隆 位 点
X-gal ：5-溴-4-氯-3-吲哚-B-D-半乳糖苷
表示 外源 基因 插入 编码 半乳 糖苷 酶的 基因 区段
带有正确插入目的基因序列的菌落，白色菌落
不对 能照 是目 培的 养基 基因 变本 色身
使用含Amp+X-Gal的琼脂糖平板筛选克隆，可能出现三种情况。 1 . 载体自身环化，产生蓝色菌落； 2 带有正确插入目的基因序列的菌落，白色菌落。 3 未转化的细胞，不能生长。
目的基因插入 到抗四环素基 因的位置，则 导入菌体后的 菌株则不能在 有四环素的培 养基上生长
《基因克隆操作过程》PPT课件
CGATCC GCTAGG
GGATCG CCTAGC
基因克编隆辑操pp作t 过程
GGATC CCTAG 5'
c)目的产物中 对应位置的序 5' 列不再是原来 的酶切位点
5'
14
（4）双酶联合酶切产生的不同粘性末端的连接
CTGCAGNNNNNNNNNGGATCC GACGTCNNNNNNNNNCCTAGG
PstI
BamHI
GGATCC CCTAGG
BamHI
CTGCA G
a)连接产物中 目的基因的方 向是确定的。
2011-10-23
GATCC G
退火
GATCC G
CTGCA G G ACGTC
G GATCC CCTAG G
T4-DNA ligase
CTGCAG GACGTC
GGATCC CCTAGG
Takara网站提供的同尾酶信息
编辑ppt
12
2011-10-23
基因克隆操作过程
12
5'
TGATCA
ACTAGT
5'
BclI
5'
GGATCC
CCTAGG
BamHI
GGATCC
CCTAGG
5'
5'
T
5' GATCA
ACTAG 5'
T
5'
a)获得连接方 向不同的两种
5'
产物；
退火
T GATCC ACTAG G
DNA ligase
切
接
转
增 检
2011-10-23
基因克编隆辑操pp作t 过程
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36
识别4个碱基 识别6个碱基 识别8个碱基
1/44=1/256 1/46=1/4096 1/48=1/65536
37
20
一、Restriction Endonucleases 1 定义
限制性核酸内切酶（限制酶），是 一类能识别和切割双链DNA分子内特 定碱基顺序的核酸水解酶。
21
Restriction Endonucleases
Made by bacteria and viruses. Over 500 Restriction endonucleases exist. These will cleave over 80 specific sequences.
• 接下来的字母代表寄主菌的株或型。 • 如果从一种菌株中发现了几种限制酶，则根据
发现和分离的顺序用罗马字母表示。
从大肠杆菌（E.coli）R菌株分离到的几种限
制酶，分别表示为EcoRⅠ、 EcoRⅡ 、 EcoRⅤ等。
29
Restriction Endonuclease Enzymes
30
4 Ⅱ型酶作用特点
Ⅰ. 5’ AGTTGA 3’ Ⅱ. 5’ GCACGTGC 3’ Q: If show below is ½ of a RE site, what is the DNA
sequence for the remaining ½? 5’ TCA _ _ _ 3’
35
从理论上讲，如果DNA链上的A、T、 C和G四种碱基随机分布，根据限制酶 识别碱基的个数可估算限制酶的切割几 率 ， 同 时 也 决 定 了 它 切 割 DNA 后 产 生 的DNA片段的长度。实际上，限制酶 对DNA的切割是“全”或“无”。
Ⅱ型酶有严格的识别、切割顺 序 ， 以 内 切 方 式 水 解 双 链 DNA 中 的 磷 酸 二 酯 键 ， 产 生 的 DNA 片段5’端为P，3’端为OH。
31
32
识别顺序一般为4—6个碱基，通常是反 转重复顺序，具有180°的旋转对称性,也称 回文结构，palindrome,具有对称结构的 DNA片段。一条链上的碱基顺序（例如从 5‘3’）和另一条链上从5‘ 3’的顺 序完全相同。例如，
Herbert Boyer
Stanley N. Cohen 12
“工程鲫”、“工程 鲤”
13
14
多 利 和 它 的 孩 子
15
沃 尔 小 组 成 功 克 隆 两 只 恒 河
猴 16
吴明杰小组：5只克 隆猪
17
18
19
第二节 重要的工具酶
限制性核酸内切酶； DNA聚合酶； DNA连接酶； T4多核苷酸激酶； 碱性磷酸酶。
These sites are DNA sequence that are identical on both DNA strands.
34
Q: Which of the following 2 DNA sequences is a potentional RE recognition site?
23
2 分类
限制酶可分为3型。
➢I型和Ⅲ型限制酶同时具有限制与修 饰两种功能; ➢I型限制酶没有固定的切割位点，随 机切割产生非专一切口；
24
➢ Ⅲ型限制酶在DNA链上有特异切割位点， 但其切割位点在识别位点以外。
I型和Ⅲ型限制酶在分子克隆中用途 不大。通常所指的限制酶是Ⅱ型酶。
25
Ⅱ型酶对DNA水解有很强的特异性， 它要求严格的顺序作为切割点。切点顺 序中有一个碱基的变异、缺失或修饰， 便不再被水解，因此在分子克隆中常用， 它被誉为分子生物学家的手术刀。
6
7
三、意义
重组DNA技术填平了生物种属间不可逾越 的鸿沟； 重组DNA技术缩短了进化时间； 重组DNA技术使人能对生物进行定向改造。
8
9
基因工程大事记
1973 Cohen第一例成功的克隆实验 1978 Genentech公司 人胰岛素 世界上 第一种基因工程蛋白药物 1982 第一个基因工程药物--重组人胰岛素 在英、美获准使用 1985 第一批转基因家畜（兔、猪和羊）， 中国 转基因鱼
Ex. EcoRⅠ GAATT C
C TTAAG
26
Agarose Gel Electrophoresis
27
3 命名原则
H ． O ． Smith 和 D．Nathams(1973)提议的命名系统 已被公众所接受，其命名原则如下：
28
• 限制酶第一个字母(大写，斜体)代表该酶的微 生物(寄主菌)属名；第2、3个字母(小写，斜体) 代表微生物种名。
基因工程及体外表达体 系（1）.酶
心血管病研究所 王佐
1
基因工程及体外表达体系பைடு நூலகம்
酶 载体 方法
2
第一节 概述
定义 基本步骤 意义
3
定义：应用酶学的方法，在体外将目的 基因与载体DNA结合成一具有自 我复制能力的DNA分子（复制 子、重组体），继而通过转化或 转染宿主细胞、筛选出含有目的 基因的转化子细胞，再进行扩 增、提取获得大量同一DNA分子 拷贝，或其表达产物。
1993 基因工程西红柿在美国上市 1997 英国罗斯林研究所 多莉羊 1999.9 中国获准加入人类基因组计划.
负责测定人类基因组全部序列的1% 2000.6.26科学家公布人类基因组工作草图 2001.2.11 公布人类基因组基本信息 生物技术工程：基因工程、蛋白质工程、 酶工程、细胞工程、干细胞
4
Recombinant DNA technology Gene cloning Molecular cloning Gene engineering Genetic engineering
5
二、基本步骤
目的基因的获得； 目的基因与载体的连接； 重组DNA分子导入受体细胞； 筛选出含重组DNA分子的受体细胞克隆； 克隆基因的表达及表达产物的检测和分离 纯化。
5‘ GAATTC 3’ 3’ CTTAAC 5’
33
RE recognition/cleavage site are palindromic DNA sequences, not palidromic as in “ABBA”.
E.x. EcoRⅠ 5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5'
识别4个碱基 识别6个碱基 识别8个碱基
1/44=1/256 1/46=1/4096 1/48=1/65536
37
20
一、Restriction Endonucleases 1 定义
限制性核酸内切酶（限制酶），是 一类能识别和切割双链DNA分子内特 定碱基顺序的核酸水解酶。
21
Restriction Endonucleases
Made by bacteria and viruses. Over 500 Restriction endonucleases exist. These will cleave over 80 specific sequences.
• 接下来的字母代表寄主菌的株或型。 • 如果从一种菌株中发现了几种限制酶，则根据
发现和分离的顺序用罗马字母表示。
从大肠杆菌（E.coli）R菌株分离到的几种限
制酶，分别表示为EcoRⅠ、 EcoRⅡ 、 EcoRⅤ等。
29
Restriction Endonuclease Enzymes
30
4 Ⅱ型酶作用特点
Ⅰ. 5’ AGTTGA 3’ Ⅱ. 5’ GCACGTGC 3’ Q: If show below is ½ of a RE site, what is the DNA
sequence for the remaining ½? 5’ TCA _ _ _ 3’
35
从理论上讲，如果DNA链上的A、T、 C和G四种碱基随机分布，根据限制酶 识别碱基的个数可估算限制酶的切割几 率 ， 同 时 也 决 定 了 它 切 割 DNA 后 产 生 的DNA片段的长度。实际上，限制酶 对DNA的切割是“全”或“无”。
Ⅱ型酶有严格的识别、切割顺 序 ， 以 内 切 方 式 水 解 双 链 DNA 中 的 磷 酸 二 酯 键 ， 产 生 的 DNA 片段5’端为P，3’端为OH。
31
32
识别顺序一般为4—6个碱基，通常是反 转重复顺序，具有180°的旋转对称性,也称 回文结构，palindrome,具有对称结构的 DNA片段。一条链上的碱基顺序（例如从 5‘3’）和另一条链上从5‘ 3’的顺 序完全相同。例如，
Herbert Boyer
Stanley N. Cohen 12
“工程鲫”、“工程 鲤”
13
14
多 利 和 它 的 孩 子
15
沃 尔 小 组 成 功 克 隆 两 只 恒 河
猴 16
吴明杰小组：5只克 隆猪
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第二节 重要的工具酶
限制性核酸内切酶； DNA聚合酶； DNA连接酶； T4多核苷酸激酶； 碱性磷酸酶。
These sites are DNA sequence that are identical on both DNA strands.
34
Q: Which of the following 2 DNA sequences is a potentional RE recognition site?
23
2 分类
限制酶可分为3型。
➢I型和Ⅲ型限制酶同时具有限制与修 饰两种功能; ➢I型限制酶没有固定的切割位点，随 机切割产生非专一切口；
24
➢ Ⅲ型限制酶在DNA链上有特异切割位点， 但其切割位点在识别位点以外。
I型和Ⅲ型限制酶在分子克隆中用途 不大。通常所指的限制酶是Ⅱ型酶。
25
Ⅱ型酶对DNA水解有很强的特异性， 它要求严格的顺序作为切割点。切点顺 序中有一个碱基的变异、缺失或修饰， 便不再被水解，因此在分子克隆中常用， 它被誉为分子生物学家的手术刀。
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三、意义
重组DNA技术填平了生物种属间不可逾越 的鸿沟； 重组DNA技术缩短了进化时间； 重组DNA技术使人能对生物进行定向改造。
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基因工程大事记
1973 Cohen第一例成功的克隆实验 1978 Genentech公司 人胰岛素 世界上 第一种基因工程蛋白药物 1982 第一个基因工程药物--重组人胰岛素 在英、美获准使用 1985 第一批转基因家畜（兔、猪和羊）， 中国 转基因鱼
Ex. EcoRⅠ GAATT C
C TTAAG
26
Agarose Gel Electrophoresis
27
3 命名原则
H ． O ． Smith 和 D．Nathams(1973)提议的命名系统 已被公众所接受，其命名原则如下：
28
• 限制酶第一个字母(大写，斜体)代表该酶的微 生物(寄主菌)属名；第2、3个字母(小写，斜体) 代表微生物种名。
基因工程及体外表达体 系（1）.酶
心血管病研究所 王佐
1
基因工程及体外表达体系பைடு நூலகம்
酶 载体 方法
2
第一节 概述
定义 基本步骤 意义
3
定义：应用酶学的方法，在体外将目的 基因与载体DNA结合成一具有自 我复制能力的DNA分子（复制 子、重组体），继而通过转化或 转染宿主细胞、筛选出含有目的 基因的转化子细胞，再进行扩 增、提取获得大量同一DNA分子 拷贝，或其表达产物。
1993 基因工程西红柿在美国上市 1997 英国罗斯林研究所 多莉羊 1999.9 中国获准加入人类基因组计划.
负责测定人类基因组全部序列的1% 2000.6.26科学家公布人类基因组工作草图 2001.2.11 公布人类基因组基本信息 生物技术工程：基因工程、蛋白质工程、 酶工程、细胞工程、干细胞
4
Recombinant DNA technology Gene cloning Molecular cloning Gene engineering Genetic engineering
5
二、基本步骤
目的基因的获得； 目的基因与载体的连接； 重组DNA分子导入受体细胞； 筛选出含重组DNA分子的受体细胞克隆； 克隆基因的表达及表达产物的检测和分离 纯化。
5‘ GAATTC 3’ 3’ CTTAAC 5’
33
RE recognition/cleavage site are palindromic DNA sequences, not palidromic as in “ABBA”.
E.x. EcoRⅠ 5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5'