酶学分析技术一

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2-氯-硝基酚-α-岩藻糖苷 α-岩藻糖苷酶（AFU） 2-CP（405nm，pH6.5） 6.2
（二）间接法 是指加入相应试剂后间接测定酶促反应的产物转化物或 底物转化物的理化指标以测定酶活性的方法。 酶偶联法
化学法
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1．酶偶联法
原理：在测定待测酶Ex的活性时，常采用偶联一个工具酶（指示酶Ei） 或几个工具酶（辅助酶Ea和指示酶Ei）将待测酶的某一产物转化为新的 产物，反应速率达到平衡时，测定指示酶的反应速率来代表待测酶的活 性。反应模式可简化为：
缺点： 需要制备足够量的提纯酶作为抗原和具有免疫化学性质的抗血清 测定步骤多，操作繁琐 成本高
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三、酶促反应进程
吸 光 度 A
以产物生成量（或反 应物减少量）为纵坐标、 反应时间为横坐标作图所 得到的一条曲线，称为反 应进程曲线（或反应时间 曲线、速率曲线、时间曲 线）
延 滞 期
非 线 性 期 线 性 期
测定结果常较定时法高，因为在酶促反应初始阶段底物最充裕，而 产物的抑制作用、可逆反应、酶变性等均很小，所以吸光度等检测 信号就比定时法要高且真实，因而测定结果也较定时法准确。
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二、按照检测对象分类的酶活性测定方法
（一）直接法
指直接测定酶促反应产物或底物的理化指标以测定酶活性的方法。 测定NAD（P）H的方法 测定人工合成的色素原底物的方法 测定耗氧量的方法 测定pH改变的方法 等
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要准确测定酶活性，必须找到酶促反应的线性期， 即在过量底物存在条件下的零级反应期的速度，此 时测定的反应速度才能代表酶活性，也是检验酶促 反应和检测系统是否适宜的标准。
传统手工方法无法准确在线性期测定酶促反应速度， 故结果不准确。 自动生化仪能方便，准确找到线性期，结果可靠准 确。
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四、酶促反应动力学
表示方法：
d [ P] v dt
或
v
d[S ] dt
式中v：反应速率，[P ]：产物浓度，t：时间，[S]：底物浓度。
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二、酶活性单位与酶活性浓度
（一）酶活性单位
定义：表示酶的相对含量，指在一定条件下，单位时间内 生成一定量的产物或消耗一定量的底物所催化的酶量。 表示方法： 惯用单位（一定的反应量/一定的反应时间）
2H 2 O 醌亚胺(红色) Trinder反应： 2H 2 O2 4 AAP 酚
POD
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表5-4 一些酶偶联法的待测酶与工具酶
待测酶 ALT AST CK 5‘-核苷酸酶（5‘NT） LPS 辅助酶 无 LD* HK 腺苷脱氨酶（ADA） 共脂酶、甘油激酶 （GK）、GPO 指示酶 LD LD、苹果酸脱氢酶 （MD） G6PD GLDH POD 指示系统 NAD(P)H NAD(P)H NAD(P)H NAD(P)H H2O2
定时法与两点法、终点法的区别
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t1 时间 t2 图5-6 定时法的三种反应进程
（二）连续监测法
原理： 连续监测法是指在多个时间点连续测定产物（或底物）在线性 期内的生成量（或消耗量）即零级反应速率以测定酶活性的方法， 又称速率法、零级反应速率法、斜率法。 该方法是在一定的反应时间区段内（至少9～120s）每隔一定时间 l （常为2～30s）读取一次吸光度值，连续测定多点（至少 4点），然 后对吸光度数据作最小二乘法处理，再用线性期内的数据计算单位 时间内的反应速率△A/min，最后计算出酶活性。
3．Katal单位
定义：1Katal是在规定条件下，每秒钟催化1mol底物转变为产物的 酶量。1Katal＝1mol/s。
IU与Katal单位的关系：1katal = 60×106IU，1IU = 16.67nkatal
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（二）酶活性浓度
酶的含量严格说是指酶分子的质量浓度（g/L,mg/L）,但 人体内酶的含量很微量（ug/L）,常规测定很困难。 酶活性浓度指单位体积样本中的酶活性单位。国际单位用 IU/L或U/L表示。酶活性浓度才具有临床可比性，但其多数情 况下都被不严格地称为酶活性单位乃至酶活性.
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第三节 酶活性的测定
测定方法分类：
按照仪器检测方法分类：分光光度法、浊度法、荧光法、 放射性核素法、电位滴定法、电极法、量气法。 按照反应时间分类；分为定时法、连续监测法和平衡法。 按照检测对象分类：分为直接法和间接法。
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2 吸 光 度 A 3 1
一、按照反应时间分类的酶活性测定方法 （一）定时法
国际单位IU（µmol/min）
Katal单位（mol/s）
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1．惯用单位：
20世纪60年代以前根据酶活性测定方法建立者的姓氏命名的单位
ALP的金氏单位（King） 举例： 氨基移转酶的卡门氏单位（Karmen）
金氏单位：100ml血清ALP在37℃与底物作用15min，产生1mg酚。 卡门氏单位：1.0ml血清在25℃，340nm，反应体积3.0ml,光径1.0cm 时每分钟测定吸光度下降0.001，即消耗4.82 10-4μmol NADH为一 个卡门氏单位
同工酶测定
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教学要求：
掌握酶活性单位的表示方法与计算、酶活性测定的 定时法与连续监测法、代谢物的酶法测定。 熟悉酶促反应进程、酶促反应动力学、酶活性测定 的直接法与间接法、酶活性测定的影响因素。
了解同工酶产生的机理与测定方法、酶活性单位的 校准、工具酶的应用。
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第一节 酶活性测定的基本知识
第五章
酶学分析技术
1
酶（enzyme）的本质：
由活细胞产生的能高效催化特异生化反应的蛋白质，属于生物催化剂
酶的特点：
高度特异性、高度不稳定性，高效性、可调节性
酶的应用：
酶活性的检测、代谢物的酶学分析和同工酶及亚型测定用于临 床诊断和疗效判断
2
主要内容：
酶活性测定的基本知识 酶活性的测定
代谢物的酶法检测
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1．测定NAD（P）H的方法
原理：监测340nm吸光度的变化可以反映NAD（P）H量的 变化，其变化与待测酶的含量正相关。
对象：以NAD（P）+或NAD（P）H为辅酶的脱氢酶类。例 如LD、G-6-PD、GLDH等 。
L 乳酸 NAD LDH 丙酮酸 NADH＋H
E E
绝对定量法（酶量直接测定法）：免疫学方法
酶测定 相对定量法（酶活性间接测定法）：生化检测方法
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简介内容：
一、酶活性 二、酶活性单位与酶活性浓度 三、酶促反应进程 四、酶促反应动力学
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一、酶活性
定义：酶活性（enzyme activity）也称为酶活力，指 酶促反应速率，即规定条件下在单位时间内产物的生成 量或底物的减少量。
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（三）非线性期（偏离线性期、平坦期 ）
进入非线性期的原因：
反应的不断进行，底物消耗越来越多，酶变性失活增加、可逆反 应增强、产物抑制增加等使得反应速率明显下降。
特点：
若为单底物的反应，则此时反应速率与单底物浓度[S]的一次方 成正比，为一级反应。如果反应速度受2种或2种以上物质浓度的影 响，则反应为一级，二级，多级反应。此时酶促反应速度不再与酶 活性成正比。
[A]》Kmx
A B C D 零级反应 一级反应 一级反应
Ex、Ea、Ei这一连串酶促反应称为酶偶联体系
Ex
[B]《Kma
Ea
Ei
指示酶的反应系统： 以NAD（P）+或NAD（P）H为辅酶的脱氢酶类作为指示酶，监测其反应物 NAD（P）H于340nm处紫外吸收或在紫外激发光365nm波长照射下，其在 460nm发射强烈荧光的变化速率的测定系统 ； 是偶联过氧化氢（H2O2）以过氧化物酶（POD）为指示酶的测定系统。
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酶蛋白质量浓度表示法
免疫学方法：利用酶蛋白分子具有抗原性的特点，可以通过抗原-抗体反 应的原理直接测定酶的质量（ng/L,ug/L）. 优点： 灵敏度高
可测定少量酶或者痕量酶
特意性高
不受体液中其他物质影响，如酶抑制剂，激活剂等
如酶原，去辅基酶蛋白，无活性的酶蛋白
测定不表现活性的酶蛋白
同工酶测定
U /L
A min
K
A 106 V U /L min l v
K为酶活性浓度定量系数，为常数，£为摩尔吸光系数，V溶液体 积，v为样本体积
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特点： 与定时法相比，属于即时观测，无需停止酶促反应、不需添加其他 呈色试剂，且可将多点的测定结果绘图连线，快速、直观查看酶促 反应进程，很容易找到呈直线的线性期，检查到是否偏离零级反应； 连续监测法要求不显色而是直接测定底物（或辅助底物即中间底物） 或产物量的变化，因此，在测定原理上，可以选择紫外吸收法或生 色原显色法； 要求能够准确地控制温度、pH值和底物浓度等，要求仪器具有恒温 装臵及自动监测功能，半自动及全自动生化分析仪都能满足这些要 求 ；
t1 图5-1
t2 酶促反应进程曲线
时间t
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（一）延滞期（lag phase、延迟期 ）
特点：为反应的初始阶段，反应速率一开始时较慢，通常为几秒到几分钟
吸 光 度
A
延 滞 期
非 线 性 期
延 滞 期
孵 育 期
R1
线 性 期
R2
t1 图5-1
t2 酶促反应进程曲线
时间t
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（二）线性期
特点：酶促反应速度达到最大速度，并且保持恒定速度 进行反应的时期。 反应速度不受底物浓度影响，称为零级反应。 此期间酶活性与酶促反应速度呈正比，为酶活性测定的最 佳时期，一般为1-5分钟。
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2．测定人工合成的色素原底物的方法
原理： 一些水解酶类或转移酶类通过酶促反应后，其化合物中的某一基团 被水解或转移，使无色的底物转变为有色的产物，这类底物称为色素原 底物。根据这一原理，可以人为地合成一系列底物即人工合成的色素原 底物后测定酶活性。 底物和测定对象：
人工合成的色素原底物 对硝基苯酚磷酸二钠盐 （PNPP-Na2） L-γ-谷氨酰-3-羧基对硝基 苯胺 2-氯-硝基酚-α-半乳糖-麦 芽糖苷 待测酶 ALP GGT AMS 产物的毫摩尔吸光系数 对硝基酚（PNP） （405nm，pH10.3）18.5 2-硝基-5-氨基苯甲酸 （405nm，pH8.1）9.49 2-氯酚（2-CP）（405nm， pH6.0）6.1
特点：各单位对温度、时间、物质量的定义不同，导致各测 定值、参考范围相差很大，彼此间无法比较,现在临床应用较 少。
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2.国际单位IU（µmol/min）
IFCC,2001年 37℃
定义：在规定条件下（25℃及其他最适条件），每min催化1µmol 底物转变为产物的酶量，为1IU或1U，1IU=1µmol/min。
原理： 定时法是固定时间法的简称，是指测定反应开始后一段时间（ t1～ t2）产物的增加量或底物的减少量以测定酶活性的方法。该方法一般需 要在反应进行到一定时间后用强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止反应。 特点： 优点：简单，因为最后测定时酶促反应已被终止，故比色时不需要 保温设备，显色剂的选择也可不考虑对酶活性的影响。 缺点：如果不做预试验则无法了解其酶促反应进程（t1-t2）是否 为零级反应，故难以确保测定结果的准确性。
研究内容：
研究酶促反应的速率及其各种影响因素（如底物浓度、 酶活性浓度、温度、pH、激活剂和抑制剂等）的科学
研究意义:
指导选择底物种类、确定底物浓度，确定最适温度、最 适pH、激活剂和抑制剂类型与含量等，从而准确测定酶活性 或代谢物浓度。
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（一）酶促反应
酶促反应式
K4
米氏方程：
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（二）Km的含义与意义
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Βιβλιοθήκη Baidu三）Vmax的含义
定义：Vmax表示在一定酶量时的最大反应速率，即酶完 全被底物所饱和时的反应速率，与酶活性浓度呈正比。 应用：计算酶的转换数（TN，催化常数Kcat）单位时间内每 个酶分子将底物分子转换成产物的最大值 。
计算公式为：
V max TN E
(单位是s-1)
计算时要保证酶的浓度单位与底物的浓度单位一致）
1．Km的含义:
V max 当Km=[S]时， v ，可见Km值等于反应速率达到最大反应速率Vmax 2 一半时的底物浓度。
2．Km的意义
Km是酶的一个特征性常数（其他如等电点），Km的大小只与酶的性质有关 反映酶对底物亲和力的大小 选择酶的最适底物或天然底物 计算不同底物浓度时的反应程度 鉴别酶的种类 如同工酶的测定 判断可逆反应的速率 判断酶偶联反应的限速反应 计算工具酶的用量