玻璃化冷冻液套装及其设备制作方法与制作流程

本技术介绍了一种玻璃化冷冻液套装及其制备方法，所述套装包括基础液、冷冻液1和冷冻液2；所述基础液包括M199组织培养液，所述冷冻液1包括基础液、体积比为5％9.5％乙二醇和体积比为5％9.5％二甲基亚砜，所述冷冻液2包括基础液、体积比为12％20％乙二醇、体积比为12％20％二甲基亚砜、蔗糖

0.41.2M/L。

技术要求

1.一种玻璃化冷冻液套装，其特征在于，所述套装包括基础液、冷冻液1和冷冻液2；所述基础液包括

M199组织培养液，所述冷冻液1包括基础液、体积比为5％-9.5％的乙二醇和体积比为5％-9.5％的二甲基亚砜，所述冷冻液2包括基础液、体积比为12％-18％的乙二醇、体积比为12％-18％的二甲基亚砜、蔗

糖0.4-1.2M/L。

2.如权利要求1所述的玻璃化冷冻液套装，其特征在于，所述基础液为经4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲的M199组织培养液,所述M199组织培养液含人血白蛋白。

3.如权利要求2所述的玻璃化冷冻液套装，其特征在于，所述人血白蛋白含量为5-15mg/mL，所述HEPES 含量为5-25mM/L。

4.如权利要求1所述的玻璃化冷冻液套装，其特征在于，所述基础液的组分及配比为每1L M199组织培养液含7.5-20mM HEPES和6.25-12.5mg/mL人血白蛋白；冷冻液1的组分及配比为每1L基础液含乙二醇

5.56％-8.38％(v/v)，二甲基亚砜5.56％-8.38％(v/v)；冷冻液2的组分及配比为每1L基础液含乙二醇

12.75％-16.5％(v/v)，二甲基亚砜12.75％-16.5％(v/v)，蔗糖0.4-1.0M。

5.如权利要求1所述的玻璃化冷冻液套装，其特征在于，所述基础液的组分及配比为每1L M199组织培养液含10-17.5mM HEPES和7.5-11.25mg/mL人血白蛋白；冷冻液1的组分及配比为每1L基础液含乙二醇

6.13％-

7.81％(v/v)，二甲基亚砜6.13％-7.81％(v/v)；冷冻液2的组分及配比为每1L基础液含乙二醇

13.5％-15.75％(v/v)，二甲基亚砜13.5％-15.75％(v/v)，蔗糖0.6-1.0M。

6.如权利要求1所述的玻璃化冷冻液套装，其特征在于，所述基础液的组分及配比为每1L M199组织培养液含15mM HEPES和10mg/mL人血白蛋白；冷冻液1的组分及配比为每1L基础液含乙二醇

7.45％(v/v)，二甲基亚砜7.45％(v/v)；冷冻液2的组分及配比为每1L基础液含乙二醇15％(v/v)，二甲基亚砜15％(v/v)，蔗糖1M。

7.如权利要求1所述的玻璃化冷冻液套装，其特征在于，所述基础液的参透压为280-300mOsm/Kg。

8.如权利要求1所述的玻璃化冷冻液套装，其特征在于，所述基础液、冷冻液1和冷冻液2的pH值分别为7.2-7.6，细菌内毒素分别小于0.25EU/mL。

9.一种制备玻璃化冷冻液套装的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)按配比量取HEPES及人血白蛋白，并加入M199组织培养液中搅拌混匀，获得基础液；

(2)按配比分别量取乙二醇、二甲基亚砜加入到适量基础液中混匀，并用基础液定容至配制量获得冷冻液1；

(3)按配比称量蔗糖，溶于基础液中；

(4)按配比分别量取乙二醇，二甲基亚砜并加入步骤3所述含蔗糖的基础液并混匀，获得冷冻液2；

(5)将获得的基础液、冷冻液1和冷冻液2进行除菌过滤并分装至无菌PP管中并封装。

10.如权利要求1所述的玻璃化冷冻液套装在配子和胚胎的冷冻和保藏中的应用。

技术说明书

一种玻璃化冷冻液套装及其制备方法

技术领域

本技术属于辅助生殖领域，涉及辅助生殖领域中配子或胚胎冷冻保存技术，尤其涉及一种人配子或胚胎的玻璃化冷冻液套装及其制备和使用方法。

背景技术

胚胎冷冻技术适用于冻存试管婴儿周期中剩余胚胎，或在移植窗口不适宜进行新鲜胚胎移植时将胚胎冻存。随着我国女性育龄的不断升高和不孕不育人数增多，胚胎冷冻也成为女性生育力保存的重要手段。

玻璃化冷冻技术是利用高浓度的冷冻保护剂，在极高的冷冻速率下，样本从液态直接转变为无固定形状的玻璃态的过程。玻璃化可避免有害冰晶的产生。因玻璃化冷冻技术效率高、成本低及操作简单等优势，正逐步替代传统程序式冷冻，成为各生殖医学中心的首选冻存方法。

玻璃化冷冻是一种对样本较大应激的过程，主要体现在冷冻保护剂毒性和低温损伤。现有技术的玻璃化冷冻液的基础液为简单培养液成分，不能很好地减轻冷冻损伤和保护样本。为此，需有一种基于复杂基础液的玻璃化冷冻和解冻液，以解决上述问题。

技术内容

本技术的目的是解决上述问题或提供另一种选择，为此，本技术提供了一种玻璃化冷冻液套装，有效地克服现有技术之缺陷，显著提高玻璃化冷冻效率。

为此，本技术提供了一种玻璃化冷冻液套装，所述套装包括基础液、冷冻液1和冷冻液2；所述基础液包括M199组织培养液，所述冷冻液1包括基础液、体积比为5％-9.5％乙二醇和体积比为5％-9.5％二甲基亚砜，所述冷冻液2包括基础液、体积比为12％-20％乙二醇、体积比为12％-20％二甲基亚砜、蔗糖0.4-1.2M/L。

进一步地，所述基础液为经4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲的M199组织培养液。

进一步地，所述M199组织培养液含人血白蛋白。

进一步地，所述人血白蛋白浓度为5-15mg/mL，所述HEPES缓冲液含量为5-25mM/L。

进一步地，所述基础液的参透压为280-300mOsm/Kg。

进一步地，所述基础液、冷冻液1和冷冻液2的pH值分别为7.2-7.6，细菌内毒素分别小于0.25EU/mL。

本技术还提供了一种制备玻璃化冷冻液套装的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)按配比量取HEPES及人血白蛋白，并加入M199组织培养液中搅拌混匀，获得基础液；

(2)按配比分别量取乙二醇、二甲基亚砜加入到适量基础液中混匀，用基础液定容至配制量获得冷冻液1；

(3)按配比称量蔗糖，溶于基础液中；

(4)按配比分别量取乙二醇，二甲基亚砜并加入步骤3所述含蔗糖的基础液并混匀，获得冷冻液2；

(5)将获得的基础液、冷冻液1和冷冻液2进行除菌过滤并分装至无菌PP管中并封装。

本技术还提供了一种玻璃化冷冻液套装的使用方法。

本技术所述的玻璃化冷冻液套装能有效缓和玻璃化冷冻中低温损伤对人配子或胚胎的影响，提高了玻璃化冷冻的效果和稳定性。

具体实施方式

以下通过具体的实施例进一步对本技术进行说明，不能理解为是对本技术的限制，实施例中使用的材料、试剂，仪器设备如无特殊说明，均可从商业途径得到。

【实施例1】玻璃化冷冻液套装的组分及其配比

本技术所述玻璃化冷冻液套装的组分包括基础液、冷冻液1和冷冻液2，优选配比1-7如下：

表1.玻璃化冷冻液套装1