玻璃化冷冻液套装及其设备制作方法与制作流程

本技术介绍了一种玻璃化冷冻液套装及其制备方法，所述套装包括基础液、冷冻液1和冷冻液2；所述基础液包括M199组织培养液，所述冷冻液1包括基础液、体积比为5％9.5％乙二醇和体积比为5％9.5％二甲基亚砜，所述冷冻液2包括基础液、体积比为12％20％乙二醇、体积比为12％20％二甲基亚砜、蔗糖
0.41.2M/L。

技术要求
1.一种玻璃化冷冻液套装，其特征在于，所述套装包括基础液、冷冻液1和冷冻液2；所述基础液包括
M199组织培养液，所述冷冻液1包括基础液、体积比为5％-9.5％的乙二醇和体积比为5％-9.5％的二甲基亚砜，所述冷冻液2包括基础液、体积比为12％-18％的乙二醇、体积比为12％-18％的二甲基亚砜、蔗
糖0.4-1.2M/L。

2.如权利要求1所述的玻璃化冷冻液套装，其特征在于，所述基础液为经4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲的M199组织培养液,所述M199组织培养液含人血白蛋白。

3.如权利要求2所述的玻璃化冷冻液套装，其特征在于，所述人血白蛋白含量为5-15mg/mL，所述HEPES 含量为5-25mM/L。

4.如权利要求1所述的玻璃化冷冻液套装，其特征在于，所述基础液的组分及配比为每1L M199组织培养液含7.5-20mM HEPES和6.25-12.5mg/mL人血白蛋白；冷冻液1的组分及配比为每1L基础液含乙二醇
5.56％-8.38％(v/v)，二甲基亚砜5.56％-8.38％(v/v)；冷冻液2的组分及配比为每1L基础液含乙二醇
12.75％-16.5％(v/v)，二甲基亚砜12.75％-16.5％(v/v)，蔗糖0.4-1.0M。

5.如权利要求1所述的玻璃化冷冻液套装，其特征在于，所述基础液的组分及配比为每1L M199组织培养液含10-17.5mM HEPES和7.5-11.25mg/mL人血白蛋白；冷冻液1的组分及配比为每1L基础液含乙二醇
6.13％-
7.81％(v/v)，二甲基亚砜6.13％-7.81％(v/v)；冷冻液2的组分及配比为每1L基础液含乙二醇
13.5％-15.75％(v/v)，二甲基亚砜13.5％-15.75％(v/v)，蔗糖0.6-1.0M。

6.如权利要求1所述的玻璃化冷冻液套装，其特征在于，所述基础液的组分及配比为每1L M199组织培养液含15mM HEPES和10mg/mL人血白蛋白；冷冻液1的组分及配比为每1L基础液含乙二醇
7.45％(v/v)，二甲基亚砜7.45％(v/v)；冷冻液2的组分及配比为每1L基础液含乙二醇15％(v/v)，二甲基亚砜15％(v/v)，蔗糖1M。

7.如权利要求1所述的玻璃化冷冻液套装，其特征在于，所述基础液的参透压为280-300mOsm/Kg。

8.如权利要求1所述的玻璃化冷冻液套装，其特征在于，所述基础液、冷冻液1和冷冻液2的pH值分别为7.2-7.6，细菌内毒素分别小于0.25EU/mL。

9.一种制备玻璃化冷冻液套装的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)按配比量取HEPES及人血白蛋白，并加入M199组织培养液中搅拌混匀，获得基础液；
(2)按配比分别量取乙二醇、二甲基亚砜加入到适量基础液中混匀，并用基础液定容至配制量获得冷冻液1；
(3)按配比称量蔗糖，溶于基础液中；
(4)按配比分别量取乙二醇，二甲基亚砜并加入步骤3所述含蔗糖的基础液并混匀，获得冷冻液2；
(5)将获得的基础液、冷冻液1和冷冻液2进行除菌过滤并分装至无菌PP管中并封装。

10.如权利要求1所述的玻璃化冷冻液套装在配子和胚胎的冷冻和保藏中的应用。

技术说明书
一种玻璃化冷冻液套装及其制备方法
技术领域
本技术属于辅助生殖领域，涉及辅助生殖领域中配子或胚胎冷冻保存技术，尤其涉及一种人配子或胚胎的玻璃化冷冻液套装及其制备和使用方法。

背景技术
胚胎冷冻技术适用于冻存试管婴儿周期中剩余胚胎，或在移植窗口不适宜进行新鲜胚胎移植时将胚胎冻存。

随着我国女性育龄的不断升高和不孕不育人数增多，胚胎冷冻也成为女性生育力保存的重要手段。

玻璃化冷冻技术是利用高浓度的冷冻保护剂，在极高的冷冻速率下，样本从液态直接转变为无固定形状的玻璃态的过程。

玻璃化可避免有害冰晶的产生。

因玻璃化冷冻技术效率高、成本低及操作简单等优势，正逐步替代传统程序式冷冻，成为各生殖医学中心的首选冻存方法。

玻璃化冷冻是一种对样本较大应激的过程，主要体现在冷冻保护剂毒性和低温损伤。

现有技术的玻璃化冷冻液的基础液为简单培养液成分，不能很好地减轻冷冻损伤和保护样本。

为此，需有一种基于复杂基础液的玻璃化冷冻和解冻液，以解决上述问题。

技术内容
本技术的目的是解决上述问题或提供另一种选择，为此，本技术提供了一种玻璃化冷冻液套装，有效地克服现有技术之缺陷，显著提高玻璃化冷冻效率。

为此，本技术提供了一种玻璃化冷冻液套装，所述套装包括基础液、冷冻液1和冷冻液2；所述基础液包括M199组织培养液，所述冷冻液1包括基础液、体积比为5％-9.5％乙二醇和体积比为5％-9.5％二甲基亚砜，所述冷冻液2包括基础液、体积比为12％-20％乙二醇、体积比为12％-20％二甲基亚砜、蔗糖0.4-1.2M/L。

进一步地，所述基础液为经4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲的M199组织培养液。

进一步地，所述M199组织培养液含人血白蛋白。

进一步地，所述人血白蛋白浓度为5-15mg/mL，所述HEPES缓冲液含量为5-25mM/L。

进一步地，所述基础液的参透压为280-300mOsm/Kg。

进一步地，所述基础液、冷冻液1和冷冻液2的pH值分别为7.2-7.6，细菌内毒素分别小于0.25EU/mL。

本技术还提供了一种制备玻璃化冷冻液套装的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)按配比量取HEPES及人血白蛋白，并加入M199组织培养液中搅拌混匀，获得基础液；
(2)按配比分别量取乙二醇、二甲基亚砜加入到适量基础液中混匀，用基础液定容至配制量获得冷冻液1；
(3)按配比称量蔗糖，溶于基础液中；
(4)按配比分别量取乙二醇，二甲基亚砜并加入步骤3所述含蔗糖的基础液并混匀，获得冷冻液2；
(5)将获得的基础液、冷冻液1和冷冻液2进行除菌过滤并分装至无菌PP管中并封装。

本技术还提供了一种玻璃化冷冻液套装的使用方法。

本技术所述的玻璃化冷冻液套装能有效缓和玻璃化冷冻中低温损伤对人配子或胚胎的影响，提高了玻璃化冷冻的效果和稳定性。

具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步对本技术进行说明，不能理解为是对本技术的限制，实施例中使用的材料、试剂，仪器设备如无特殊说明，均可从商业途径得到。

【实施例1】玻璃化冷冻液套装的组分及其配比
本技术所述玻璃化冷冻液套装的组分包括基础液、冷冻液1和冷冻液2，优选配比1-7如下：
表1.玻璃化冷冻液套装1
冷冻液1乙二醇5％，二甲基亚砜5％，定容于1L基础液
冷冻液2乙二醇12％，二甲基亚砜12％，蔗糖0.4M，定容于1L基础液
表2.玻璃化冷冻液套装2
表3.玻璃化冷冻液套装3
组分配比
基础液HEPES 10mM，人血白蛋白7.5mg/mL，定容于1L M199组织培养液冷冻液1乙二醇6.13％，二甲基亚砜6.13％，定容于1L基础液
冷冻液2乙二醇13.5％，二甲基亚砜13.5％，蔗糖0.6M，定容于1L基础液表4.玻璃化冷冻液套装4
冷冻液1乙二醇7.45％，二甲基亚砜7.45％，定容于1L基础液
冷冻液2乙二醇15％，二甲基亚砜15％，蔗糖1M，定容于1L基础液
表5.玻璃化冷冻液套装5
表6.玻璃化冷冻液套装6
组分配比
基础液HEPES 20mM，人血白蛋白12.5mg/mL，定容于1L M199组织培养液冷冻液1乙二醇8.38％，二甲基亚砜8.38％，定容于1L基础液
冷冻液2乙二醇16.5％，二甲基亚砜16.5％，蔗糖1M，定容于1L基础液
表7.玻璃化冷冻液套装7
组分配比
基础液HEPES 25mM，人血白蛋白15mg/mL，定容于1L M199组织培养液冷冻液1乙二醇9.5％，二甲基亚砜9.5％，定容于1L基础液
冷冻液2乙二醇18％，二甲基亚砜18％，蔗糖1.2M，定容于1L基础液
【实施例2】玻璃化冷冻液套装的配制方法
本实施例以实施例1中表3所示的玻璃化冷冻液套装为例进行详细说明。

基础液的配制：
a、将配制所用到的器具高温灭菌并烘干备用，配制全过程在符合要求的洁净车间中进行；
b、准确称量20mM(4.7660g)HEPES，溶解于适量的M199组织培养液中，并用M199组织培养液定容至
1L，得到缓冲液；
c、准确量取人血白蛋白，使其含量为15mg，加入上述步骤b中的缓冲液中并定容至1L；
d、用1N HCl和1N NaOH在室温中将上述步骤c中含蛋白的缓冲液的pH调节至7.2-7.4，得到基础液。

冷冻液1的配制：
a、将配制所用到的器具高温灭菌并烘干备用，配制全过程在符合要求的洁净车间中进行；
b、准确量取乙二醇70mL，二甲基亚砜70mL，基础液860mL，混匀，得到冷冻液1。

冷冻液2的配制：
a、将配制所用到的器具高温灭菌并烘干备用，配制全过程在符合要求的洁净车间中进行；
b、准确量称量蔗糖0.5M(171.15g)，乙二醇140mL，二甲基亚砜140mL，并充分溶解于适量基础液中，最后用基础液定容至1L，得到冷冻液2。

除菌过滤和分装：
a、用孔径为0.22微米的薄膜，在百级隔离器中将上述基础液，冷冻液1和冷冻液2进行除菌过滤；
b、在百级隔离器中将过滤后的基础液，冷冻液1和冷冻液2分装至无菌PP管中并封装。

【实施例3】玻璃化冷冻液套装的检测：
1、pH值检测
取适量待测样品用pH计测量三次，取所得三个数据的平均值为结果，在7.3±0.1视为合格。

2、渗透压检测
渗透压仪校正后，取500μl基础液加样检测，读出数据，按以上方法测出3个数据，取平均值为结果，在280-300mOsm/kg视为合格。

3、细菌内毒素检测
根据中华人民共和国药典2015版要求，用鲎试剂凝胶法进行检测，结果＜0.25EU/ml视为合格。

4、细胞毒性
按GB/T 16886.5的规定进行检测，细胞毒性分数不应超过1分。

5、致敏检测
按GB/T 16886.10的规定进行检测，应无致敏反应。

6、无菌试验
根据中华人民共和国药典2015版要要求，运用薄膜过滤法，待测样品经滤膜过滤后直接接种培养基培养14天，每天观察结果，应无菌。

7、皮内刺激
按GB/T 16886.10的规定进行检测，应无皮内刺激反应。

8、热原
根据中华人民共和国药典2015版要求，应无热原反应。

9、鼠胚试验
以实施例1所述的三种优选玻璃化冷冻液套装分别进行小鼠胚胎体外培养实验，具体方法如下：
(1)小鼠超数排卵
选取4～6周龄B6D2品系小鼠10IU/只注射PMSG，48h后10IU/只注射hCG，注射完hCG后即与同品系具有交配能力的雄鼠交配。

(2)准备胚胎体外培养皿
取无菌35mm皿，用待测样品做数滴50μl液滴作为测试组培养滴，用含70IU/ml内毒素的M16培养液做数滴50μl液滴作为阳性对照组，用普通M16培养液做数滴50μl液滴作为阴性对照组，表面覆盖培养用矿物油，放5％CO2，5％O2，90％N2，饱和湿度的培养箱中过夜平衡。

(3)受精卵收集
合笼后第二天早上检栓，见栓母鼠选取后处死，取其输卵管放于预热至37℃M2操作液中，将输卵管壶腹部膨大处刺破，收集絮状受精卵团至37℃透明质酸酶滴中消化颗粒细胞，待颗粒细胞完全脱落后将受精卵转移到37℃M2中清洗数次，挑取受精胚胎待用。

(4)按冷冻及解冻方法将上述处理后的受精卵进行玻璃化冷冻和解冻；
(5)胚胎培养
上述解冻后胚胎随机平均分三组，每组不少于50枚，一组放于测试组中培养，一组放于阳性对照级培养，一组放于阴性对照组培养，培养皿放于5％CO2，5％O2，90％N2，饱和湿度的培养箱中培养96h。

(6)测试结果
培养96h后记录各组囊胚数
可接受标准：a、阳性对照组囊胚数统计学上显著低于阴性对照组囊胚数
b、阴性对照组囊胚数≥80％
(7)检测结果
基础液(HHM)，冷冻液1(HV1)，冷冻液2(HV2)
表8.玻璃化冷冻液套装检测结果
【实施例4】用玻璃化冷冻液套装保存配子或胚胎
冷冻前准备
1.将本技术所述冷冻液套装内液体预热至室温(20-27℃)；
2.准备载杆及培养皿等耗材；
3.液氮容器倒入约九成满液氮。

以保存样本为卵子为例进行卵子平衡
1.在培养皿皿盖上方用基础液和冷冻液1分别做一滴50μl液滴。

两个液滴相互靠近而不相连；
2.将卵子转移到基础液滴中，用吸胚管拔动液滴使2个液滴相连，等待3分钟；
3.在上述液滴相连处正下方做一滴50μl冷冻液1液滴，使其靠近相连处而不相连；
4. 3分钟后拔动液滴使上述3个液滴相连，等待3分钟；
5.在皿盖右侧做1滴100μl冷冻液1液滴，将卵子转移至此液滴表面中央位置并等待9分钟；
6.上一步骤等待时间剩1分钟时在培养皿盖上做两滴100μl冷冻液2液滴；
7.吸出卵子，将卵子放到冷冻液2底部，吹吸20秒；
8.在另一滴冷冻液2中重复上述操作。

以保存样本为胚胎为例进行胚胎平衡
1.培养皿盖上方用基础液和冷冻液1分别做一滴50μl、100μl液滴；
2.用吸胚管将胚胎转移到基础液滴底部，静置2分钟；
3.吸出胚胎，将胚胎转移到冷冻液1液滴表面中央位置，等待9分钟，此过程胚胎经历皱缩到体积恢复原状；
4.上一步骤等待时间剩1分钟时在培养皿盖上做两滴100μl冷冻液2液滴；
5.吸出胚胎，将胚胎放到冷冻液2底部，吹吸20秒；
6.在另一滴冷冻液2中重复上述操作。

玻璃化冷冻
1.按所用载杆(如Cryotop)使用说明将卵子或胚胎加载到载杆；
2.将载杆投入液氮；
3.将载杆在液氮中转移到冷冻支架上，并放入液氮罐内保存。

【实施例5】玻璃化冷冻液套装不同配比的冷冻效果
按实施例4所述的方法，以本技术所述不同配比的玻璃化冷冻液冷冻胚胎，一周后复苏,复苏使用的解冻套装为Kitazato产品，国械注进20163540155，将装载有样本的载杆从液氮中浸入到解冻液中解冻约1分钟，再将样本转移到稀释液中平衡约3分钟，最后在清洗液中将样本清洗平衡约5分钟)，复苏后胚胎体外转移到经预平衡的小鼠胚胎培养液(KSOM)中，并将培养皿放入37℃，5％CO2的培养箱中培养120小时，观察囊胚形成率及孵化率。

其结果如表9所示。

表9.玻璃化冷冻液套装不同配比的冷冻效果
注：
复苏率＝存活卵子数/冷冻卵子数*100％
囊胚率＝囊胚数/受精卵子数*100％
孵化率＝孵化囊胚数/囊胚数*100％
【实施例6】玻璃化冷冻液套装与市面成熟产品效果对比：
以日本Kitazato玻璃化冷冻液为对照组，以本技术实施例4中所述的配比4为实验组，未进行玻璃化冷冻的样本为新鲜组。

取小鼠卵母细胞进行玻璃化冷冻，复苏后将存活的卵母细胞进行体外受精并体外培养到囊胚阶段，统计分析并比较两者在受精和体外发育的差异。

表10.卵母细胞冷冻保存-体外受精后的体外发育
注：复苏率＝存活卵子数/冷冻卵子数*100％
受精率＝受精卵子数/存活卵子数*100％
囊胚率＝囊胚数/受精卵子数*100％
孵化率＝孵化囊胚数/囊胚数*100％
P值为实验组与对照组间差异，P＜0.05为差异具有统计学意义
以日本Kitazato玻璃化冷冻液为对照组，以本技术实施例4中所述的配比4为实验组，未进行玻璃化冷冻的样本为新鲜组。

取小鼠8-细胞胚胎进行玻璃化冷冻，复苏后将存活的胚胎进行体外受精并体外培养到囊胚阶段，统计分析并比较两者在体外发育的差异。

表11.细胞期胚胎冷冻保存/复苏后体外发育
注：复苏率＝复苏存活胚胎数/冷冻胚胎数*100％
囊胚率＝囊胚数/复苏存活胚胎数*100％
孵化率＝孵化囊胚数/囊胚数*100％
P值为实验组与对照组间差异，P＜0.05为差异具有统计学意义
以日本Kitazato玻璃化冷冻液为对照组，以本技术实施例4中所述的配比4为实验组，未进行玻璃化冷冻的样本为新鲜组。

取小鼠2-细胞胚胎进行玻璃化冷冻，复苏后将存活的胚胎进行胚胎移植，统计分析并比较两者在体内发育的差异。

表12.细胞期胚胎冷冻保存/复苏后体内发育
注：妊娠率＝妊娠受体数/受体数*100％
活产数＝出生活仔数/移植胚胎数*100％
P值为实验组与对照组间差异，P＜0.05为差异具有统计学意义
综上，本技术中最优配比的玻璃化冷冻液套装在卵子和胚胎冷冻复苏存活方面优于与已上市同类产品，冷冻后胚胎体外发育方面无明显差异，但经冷冻复苏后的胚胎移植后活产率高于对照组，差异具有统计学意义。