人源化抗体和单克隆抗体制备的主要方法课件

C.
杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体 ： ①
融合后有细胞生长，但无抗体产生，
可 能是HAT中A失效或骨髓瘤细胞发生突变，变成A抵抗细胞所致。② 有可能是免疫原抗原 性
弱，免疫效果不好。③
对于原分泌抗体的杂交瘤细胞变为阴性，可能是细胞支原体污 染，
或非抗体分泌细胞克隆竞争性生长，从而抑制了抗体分泌细胞的生长。也可能发生染 色体丢失。
软琼脂平板法。
单抗制备过程的影响因素
A.
污染：包括细菌、霉菌和支原体的污染。
B. 融合后杂交瘤不生长 ：在保证融合技术没有问题的前提下主要考虑下列因素①PEG有毒性 或作用时间过长。②牛血清的质量太差，用前没有进行严格的筛选。③骨髓瘤细胞污染了 支原体。 ④HAT有问题，主要是A含量过高或HT含量不足。
B cell
百度文库
myeloma
fusion
HAT
ELISA
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To achieve this end, we raised monoclonal
antibodies against the KcsA K+ channel
enlarge culture
purines
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HAT medium because it contains: •hypoxanthine •aminopterin •the pyrimidine thymidine
The logic: •Unfused myeloma cells cannot grow because they lack HGPRT. •Unfused normal spleen cells cannot grow indefinitely because of their limited life span. •Hybridoma cells are able to grow indefinitely because the spleen cell partner supplies HGPRT and the myeloma partner is immortal.
杂交瘤细胞的克隆化
克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。 因为经过HAT筛选后的杂交 瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。 在实际工作中，可能会有数个
甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、 抗体非分泌细胞；所需要的
抗体(特异性抗体)分泌细胞和其它无关抗体分 泌细胞。要想将这些细胞
彼此分开，就需要克隆化。克隆化的原则是， 对于检测抗体阳性的杂交
and selected clones on the
basis of their ability
to recognize the tetrameric but not the
monomeric form of the channel.
ELISA
抗體生產： 1) 可把挑選出來的融合細胞打入小鼠腹部，誘生腫瘤，然後以針頭收集所產生的腹水，通常可取15mL 左右； 腹水中的抗體濃度非常高，每 mL 可達數 mg。 2) 把融合細胞在大型培養槽中培養，收集培養液上清即得抗體，但每 mL 只得約數 mg，濃度較腹水稀約一 千倍。最近有一種細胞培養瓶，可產生如腹水般濃度的上清，但價格極為昂貴 (IBS Integra Bioscience: Integra Celline)。 3) 得到穩定的抗體後，通常要再以 ELISA 方法 檢定該抗體的 subclass 是屬於 IgG, IgM 或 IgA 等。 免疫 時 間太短的，較可能取得 IgM，但一般仍以 IgG 較多，注意 IgG 又可分成幾種 sub-subclass。 4) 所得到的抗體再經純化步驟，以除去雜質，可用下列各種方法的組合︰ • 硫酸銨分劃： 收集約 40% 飽和度的沉澱，是最經濟、方便的方法。 • 離子交換法： 用 DEAE 陰離子交換法，多用在純化 IgG。 • 膠體過濾法： 以分子量的差異分劃出各種抗體，多用在純化 IgM。
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Monoclonal antibody
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1975 with a technique devised by Köhler and Milstein (for which they were awarded a Nobel Prize).
They did this by literally fusing myeloma cells with antibody-secreting cells from an immunized mouse. The technique is called somatic cell hybridization. The result is a hybridoma(NS-1). NS-1 是穩定的小白鼠 BALB/c 癌細胞株，除了能在培養基中 永續生長外尚有一重要特性，細胞缺乏兩種 核酸代謝重要酵素 TK, thymidine kinase HGPRT, hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase
• 親和層析法： 以 Protein A-吸著劑 專一性地吸住抗體分子 (IgG)。
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抗体的检测
1. ELISA用于检测针对可溶性抗原(蛋白 质)和细胞表面抗原的mAb。 2. FACS(流式细胞仪)用于检测细胞表面抗原的mAb。 3. 用western blot检测单抗的特异性。
克隆应尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞 会被抗体非分泌的细胞所
抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体 分泌的细胞生长速度快，
二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即 使克隆化过的杂交瘤细胞 也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突 变或染色体丢失，从而丧
失产生抗体的能力。 用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀释法和