黑曲霉Aspergillus niger对人参皂苷Re的微生物转化

黑曲霉Aspergillus niger对人参皂苷Re的微生物转化

目的：筛选长白山人参土壤中的活性微生物，转化单体人参皂苷产生稀有人参皂苷成份。方法：从长白山人参根际土壤中分离各类菌株，对单体人参皂苷Re进行微生物转化，通过硅胶柱层析等方法对转化产物进行分离纯化，采用波谱解析及理化常数对其进行结构鉴定。结果：从长白山人参根际土壤中分离各类真菌菌株68株，3株真菌对三醇组人参皂苷Re具有转化作用，其中黑曲霉Aspergillus niger的转化活性较强，转化产物为人参皂苷Rg1、Rg2和Rh1。结论：首次报道黑曲霉能将人参皂苷Re转化为人参皂苷Rg1、Rg2和Rh1这一转化过程。

[Abstract] Objective: Samples of Ginseng root soils, collect from Changbai Mountain, are used to screen active microorganism which can transform Ginsenoside Re, so as to obtain rare anti-tumor components. Methods: The strains were isolated and screened on liquid transfer medium and yield transfer process for active strains. Then the active strains were tested for their biotransformation properties by using Ginsenoside Re. The biotransformation products were separated and purified through different column chromatographies and identified by spectral analysis and physical constants. Results: Total 68 fungal strains were isolated and 3 active strains showed positive activity on Ginsenoside Re. One strain, Aspergillus niger, was found to have the strong activity on Re. Conclusion: This is the first report on the transformation G-Re to G-Rg1, G-Rg2, and G-Rh1 by microorganism Aspergillus niger.

[Key words] Ginsenoside Re; Ginsenoside Rg1; Ginsenoside Rg2; Ginsenoside Rh1; Aspergillus niger; Biotransformation

人参及其制品中的主要活性成分是人参皂苷，由于人参皂苷分子结构中糖基侧链的不同而显示出不同的性质和药理活性[1-2]。例如人参皂苷Rb1有促进神经细胞生长的作用、降低细胞内钙、抗氧化、清除自由基和改善心肌缺血再灌注损伤等作用[3]；人参皂苷Rd能促进T细胞增殖，提高天然杀伤细胞（NK）的活性[4]；20（S）-原人参二醇苷元（PPD）具有抗癌活性[5]等。人参皂苷Re是抗心律失常有效成分，可抑制吗啡诱发小鼠产生的耐药性等作用；人参皂苷Rg1具有使中枢神经兴奋、抗疲劳、改善记忆、学习功能等作用[6]；人参皂苷Rg2可抑制兔血小板释放反应等作用。为了获得具有极高药用价值的稀有人参皂苷，从20世纪80年代始，国内外化学及生物技术工程研究人员便开始了人参皂苷的结构改造工程，并取得了很好的结果[7-13]。因此，从高含量人参皂苷成分获得稀有人参皂苷成分的工作备受关注。目前，用于人参皂苷糖基改造的主要方法有化学法、酶法和真菌代谢法[14-15]。真菌代谢法具有条件温和、不破坏皂苷结构、专属性、得率高、无污染等特点，被广泛应用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1主要试剂人参单体Re购自昆明赛勋生物技术有限公司；薄层色谱硅胶GF254（10～40 μm）和柱色谱硅胶H （200～300目）为青岛海洋化工有限公司生产；其他试剂均为分析纯试剂。

1.1.2 培养基①真菌分离用PDA培养基[16]。②种子培养基：每升常水含10 g葡萄糖、10 g蔗糖、10 g蛋白胨、10 g氯化铵、3 g磷酸二氢钾、3 g七水硫酸镁，pH自然，分装40 ml/250 ml三角瓶，115℃灭菌20 min。③液体转化培养基：每升含10 g葡萄糖、0.1 mg硫酸锰、2 g天冬氨酸、0.1 mg硫酸锌、1 g磷酸二氢钾、0.2 mg氯化铁、0.5 g七水硫酸镁、1 mg维生素B1、5 μg生物素，pH 6.0，分装40 ml/250 ml三角瓶，115℃灭菌20 min。

1.2 人参根际真菌的分离

取长白山2年和5年人参根际土壤样品于40～50℃烘2～3 h，取1 g烘干的土样溶于10 ml无菌蒸馏水中，将土样从10-1稀释至10-6，选择10-3、10-4、10-5、10-6 4个浓度，分别取0.1 ml用无菌三角爬把溶液均匀涂布在含有庆大霉素（50 μg/ml）的PDA平板培养基表面，25℃倒置培养7 d。挑取单一菌落经反复划线分离得纯培养，传至PDA斜面培养7 d，4℃保藏备用。

1.3 活性菌株的筛选

液体筛选方法参见文献[17]，取上清进行TLC分析。在氯仿∶甲醇（3:1）系统中展开后，挥干溶剂，喷10%（V/V）H2SO4-EtOH于105℃下显色，与人参皂苷Re所显示的斑点比较，获得液体筛选的阳性菌株，进行放大实验。

1.4 人参皂苷Re转化产物的粗处理

将具有转化作用的真菌，分别进行液体发酵转化人参皂苷Re，转化液分别进行如下纯化过程。离心，上清液用水饱和的正丁醇分别萃取3次，合并正丁醇萃取部分，浓缩得提取物A。菌丝体用甲醇提取1次，回收甲醇得提取物B，合并A、B两部分提取物。水溶解，经HPD100型大孔吸附树脂吸附，蒸馏水洗涤去除杂质，再用95%乙醇洗脱，收集95%乙醇洗脱液，浓缩。

2 结果

2.1 活性菌株的筛选

从长白山的2年和5年人参根际土壤样品中共分离获得各种类型真菌68株，通过液体筛选方法，发现具有转化人参皂苷Re的活性菌株3株，分别记为SRS-67、SRS-68和SRS-69（图1）。其中SRS-69（黑曲霉）对人参皂苷Re有较强的转化活性，另外两株真菌菌株SRS-67和SRS-68正在鉴定中。

2.2 人参皂苷Re的转化产物的分离纯化