藻类基因组学的研究进展

一、质体的分离 样品前处理 加STE常温匀浆 过滤和低速离心
二、DNA酶的处理 加ST和DNA酶酶解 三、降解质体和纯化DNA TEN降解质体 去除蛋白 纯化DNA 结果检测 停止酶解加NETF漂洗
总DNA提取的主要方法
组织液氮研磨 提取缓冲液 保温、离心 加TE 70℃保温15min 加醋酸铵冰浴30min
2. 总基因组的提取，再分离细胞器DNA
2.1 总DNA提取，超速分离细胞器的DNA
2.2 总DNA提取，层析等方法分离细胞器DNA
超速离心分离细胞器，再分离DNA
样品前期处理 结果检测 蔗糖梯度离心 分离细胞器 裂解细胞器 DNA的纯化 CsCl梯度离心
Lysis buffer: 50 mM Tris (pH 8), 100 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0.5% (w/v) SDS, 0.7% (w/v) N-lauroyl-sarcosine , 200 μg/mL proteinase K, 100 μg/mL Rnase
CTAB 提取缓冲液： 100 Tris-HCl mM TRIS-HCl pH 8.0, 1.5 M NaCl, SDS 提取缓冲液： 0.1M pH 8.0, 0.05M EDTA, 20 mM EDTA, 20 mM DTT和2% CTAB
0.5M NaCl, 1.6% SDS, 0.2% PVPP和2%β-巯基乙醇
加提取缓冲液 37 ℃ 保温1h 加等体积5.0M醋酸 钾冰浴20min,离心 水相加等体积酚:氯 仿:异戊醇(25:24:1)
方法二
结果检测
18000g离心得到DNA 沉淀、洗涤，提纯DNA
重复4、5，2/3体积预冷 异丙醇，-20℃放置过夜
氯仿:异戊醇 (24:1) 12000g离心10min
上清液加0.1mg/ml Rnase,37℃保温1h
Oltmannsiellopsis cp DNA
绿藻门分为四纲：绿色鞭毛藻纲，石莼纲、绿藻纲和
Trebouxiophyceae。
除了绿色鞭毛藻纲，其他三个纲的分类顺序还有很大的
争议。四个纲的代表种全长cpDNA序列分析表明它们
在整体结构，基因含量，内含子成分和基因顺序上都有
很大的差别
Oltmannsiellopsis和Pseudendoclonium 的cpDNA
绿藻mt基因组Βιβλιοθήκη 研究进展Scenedesmus obliquus mt DNA 反应了
绿藻线粒体基因组是进化的中间状态
Pseudendoclonium akinetum mt DNA
显示了绿藻门特色的进化趋向，石莼纲和 绿藻纲有着姐妹群的关系
Scenedesmus obliquus mt DNA分析表
因分隔可能源于藻类的远古特征
Chlorella vulgaris
tRNALeu(GAG) 未曾在陆地植物cp DNA发现 69个编码蛋白基因和8个开放阅读框存在于陆地
植物也存在于C.vulgaris
编码核糖蛋白L5, L12, L19, S9 和延长因子EFTu，未在陆地植物cp DNA中发现
方法五
液氮中组织研磨 干燥DNA,加TE溶解 弃上清，加预冷 乙醇洗涤数次 -20℃过夜，13000rpm 30’ 13000rpm离心15’ 取上清,加异丙醇
加提取缓冲液 37℃ 保温30’
13000rpm离心15’ 取上清液,Rnase 37℃ 30’,冰浴30’
提取缓冲液：100 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, 500 mM NaCl,pH 8.0 ， 2%SDS, 40 μg/ml 蛋白酶 K
解决方法
用复合酶去除大部分的糖蛋白和多糖
用幼嫩的藻体代替配子体作为材料 改进超速离心的条件提取基因组DNA
尝试非超速离心提取基因组DNA
藻类基因组DNA提取的方法
1. 先分离细胞器，再分离细胞器DNA
1.1 超速离心分离细胞器，再超速分离DNA 1.2 非超速离心分离细胞器，再分离DNA
超离分离细胞器DNA
• 氯化铯-溴化乙锭连续梯度法纯化DNA
• 氯化铯-溴化乙锭不连续梯度法纯化DNA
• Hoechst 33258 氯化铯连续梯度法纯化DNA
结构比较和功能基因组的研究
概念和名称的缩写
IR: Inverted region ML: Maximum likelihood MP: Maximum parsimony ORF: Open reading frame SDR: Short dispersed repeat LSU: Large single copy region SSU: Small single copy region
20000g离心 4’+ DNA提取缓冲液
20000g 离心 15’，弃 上清，70%乙醇洗涤
50℃保温2h+酚:氯 仿:异戊醇(25:24:1)
20000g 离心 15’ 弃上清，异丙醇
提取缓冲液: (pH 8): 100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 2%SDS, 50μg/ml 蛋白酶K
四个绿藻纲的cp DNA的结构和比较基因组的研究
Ulvophyceae 石莼纲
Prasinophyceae 绿色鞭毛藻纲
Trebouxiophyceae
Ulvophyceae 石莼纲
Chlorophyceae 绿藻纲
Gene clusters shared between Oltmannsiellopsis and other UTC algal cpDNAs
方法一
结果检测
加70%乙醇洗涤 TE溶解DNA
离心得到DNA 上清液加0.5倍 异丙醇沉淀DNA
提取缓冲液：50mMTris-HCl(pH 8.0),15%蔗糖，50mM EDTA TE缓冲液：20mM Tris-HCl (pH 8.0), 10mM EDTA, 40ul 10% SDS
液氮中组织研磨
研究的方法和项目
Expansion of Coding Regions Gene and intron contents Genome structure Repeated elements Gene partitioning Gene clustering General features
rRNA基因含量和片断模式显示了绿藻mt
DNA处于进化的过渡状态
Pseudendoclonium mtDNA 是迄今为止绿藻
最大线粒体基因组，基因密度最低
Pseudendoclonium mtDNA展示了典型的
‘‘ancestral’’ 和‘‘reduced-derived’’ 进 化模式
两个物种的基因组差别很大，Zygnema cpDNA基
因间区域有很大回文序列
Staurastrum(8 introns)和Zygnema (13introns)
cpDNAs的内含子代表陆地植物cp DNA的分支
在Zygnematales的演化中，叶绿体基因组在整体
结构，基因顺序和内含子含量都发生了很大变化
2V 95%乙醇-20℃ 15’, 11000g离心10’
100μl 高盐TE 65℃ 2’ 1~1.5V CTAB ,-20℃ 10’,11000g 离心5’ 转移上层液，加 50μg Y tRNA
加等体积氯仿:异戊醇 (24:1)12000g离心1min
方法四
剪碎组织+混合酶 液40℃保温 6h 离心,干燥,溶解
许多红藻和褐藻的cp 基因未在C.vulgaris 发现
与红藻和褐藻相比，C.vulgaris和陆地植物更具
有亲缘性
Staurastrum 和 Zygnema cpDNA结构和 比较基因组的研究
Staurastrum和Zygnema cpDNAs分别编码121
和125个基因，缺乏rRNA编码的反向重复序列
系统进化分析7个mt DNA编码的蛋白显示了
石莼纲和绿藻纲“reduced-derived” mt DNA 的姐妹群关系
寄生绿藻 Helicosporidium sp. 质体的结构和功能基因组研究
Helicosporidium 质体基因组是目前所知的最小的基
因组(37.5kb),和其他非光合作用有机体一样，它缺少 编码光合作用蛋白的基因
在四分结构，基因含量和基因密度上有很大的相似性。
比较分析表明：石莼纲和绿藻纲有极大的相似性。
Nephroselmis cp DNA
ycfI和ftsI是cp DNA以前未曾报道的基因
ftsW, rnE, ycf62, rnpB, 和 trnS(cga)只存
在于非绿藻基因
另有10个基因只存在于陆地植物叶绿体中 比较分析表明：陆地植物的四分结构和基
非超速离心分离细胞器，再分离DNA
STE缓冲液：400mM蔗糖，50mM Tris pH 7.8, 20mM EDTA-Na2, 0.2%牛血清蛋白， 0.2% β-巯基乙醇
ST缓冲液：400mM蔗糖，50mM Tris pH 7.8, 20mM
EDTA-Na2, 0.1%牛血清蛋白 TEN缓冲液：100mMTris pH 7.2, 50mM EDTA, 100mM NaCl和0.2% β-巯基乙醇 NETF缓冲液：1.25M NaCl, 50 mM EDTA, 50mM Tris pH8.0, 50mM NaF
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藻类基因组学的研究进展
目录
藻类基因组提取的方法 绿藻基因组的研究进展 红藻基因组的研究进展 褐藻基因组的研究进展 其他藻类基因组的研究
藻类基因组提取的难点
细胞壁厚，粘性多糖、糖蛋白和
色素含量高且难以去除
配子体生长速度慢，较难培养
藻类细胞器DNA提取方法不成熟
的趋合暗示着有着共同的动力趋势形成质体基因组， 随之在机体中光合系统丢失。
红藻基因组的研究进展
Gracilaria tenuistipitata var. liui的
方法三
液氮中组织研磨
加等体积2%CTAB提取 缓冲液，65 ℃保温15min
70%乙醇洗涤，干燥,100μl TE 300μl TE,0.5V 7.5M 醋酸铵，2V 95% 乙醇 70%乙醇洗涤，干燥
加等体积氯仿:异戊醇 (24:1)12000g离心1min
转移上层液加0.2体 积65 ℃ 5%CTAB
绿藻cp基因组的研究进展
石莼纲:Oltmannsiellopsis viridis 石莼纲:Pseudendoclonium akinetum 绿色鞭毛藻纲:Nephroselmis olivacea
Trebouxiophyceae: Chlorella vulgaris
绿藻纲:Chlamydomonas reinhardtii
明：在其基因组中UAG编码Leu，UCA为 翻译终止信号
Scenedesmus obliquus mt DNA 研究
Scenedesmus obliquus mt DNA编码了
42保守基因、4个独立ORF和1个内含ORF
UAG(终止密码子）变成了Leu, UCA (ser)
变成了翻译终止信号
氯仿:异戊醇 (24:1) 12000g离心10min
水相加等体积酚:氯 仿:异戊醇(25:24:1)
提取缓冲液：0.1 M Tris-HCl, pH 7.5, 1.5% SDS, 0.5 M NaCl, 10 mM β-巯基乙醇, 1% polyvinypyrrollidone
参照方法二提取的海带总DNA
基因丢失导致基因组变小，基因组无非编码的DNA,
无反向重复序列，只有一个内含子和微小的基因间距。 它编码最小的需要翻译的普遍的编码基因，消除了多 余的同功tRNA
Helicosporidium的质体基因组比apicomplexan的
非光合作用的质体的结构更加紧凑和严密
Helicosporidium 和Apicomplexa在质体基因组结构
方 法 六
组织冲洗(20%乙 醇+0.5M KAc) 组织液氮研磨 提取缓冲液 65℃保温1h 1/3V 5M KAc 冰浴 30’,15000g离心30’ 上清液加0.1mg/ml Rnase,37℃保温1h
结果检测
18000g离心得到DNA 沉淀、洗涤，提纯DNA 1V预冷异丙醇 15000g离心10’