致病三大弧菌ppt课件

1455
1536
8 28 6.81 1.018 28.62 23.3 7.41 7.22 56.22 43238
水樣二 9 30
2.81 1.022 34.79 23.8 7.91 6.28 67.92 51643
10 30.8 2.29 1.023 36.55 21.2 7.83 5.12 74.8 62429
(Environmental Microbiology 5(8),706-710 ,2003 )
致病因子
• Thermostable direct hemolysin (TDH) • TDH/ • TDH-related haemolysin (TRH) • Urease positive • Lethal toxin • 附著因子
生化鑑定
試驗
斜面
TSI
底部
產氣
硫化氫
MTM
革蘭氏染色
O/129敏感性
10μg
150μg
Oixdase
ONPG
Arginine
Lysine
Halophilism
0%及10%Nacl
6%及8%Nacl
42℃ HLGB 歐普氏
正反應
黃色 黃色 斷裂 黑色 混濁狀 陽性 生長 生長 深紫色 黃色 紫色 紫色 可生長
1168
over
over
1423
over
Fig 1. Amplification of the toxR gene by
PCR
1
2
3
4
5
V. cholerae : 0% 、 1%生長良好
• Vibrio parahaemolyticus is one of the most important food-borne pathogens in Taiwan, Japan and other coastal countries.
• Vibrio parahaemolyticus is a gram-negative, halophilic bacterium that occurs naturally in estuarine environments world-wide.
than 1% of food or environmental strains produce TDH.
( ) APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Mar. 2003
Aim
橫跨四季有系統地蒐集﹑保存與研究台灣南 部海域中的腸炎弧菌，並且進行一些基本特性 分析，進而由分析結果來評估腸炎弧菌在台灣 南部海域的分佈情形，而最後再來加以更深入 的探討。
8 29 4.93 1.022 34.38 16 8.27 5.34 72.8 58467
over
水樣一 9 29 29
1.024 37.05
11 8.11 4.99 73.54 56524
10 30.2 4.45 1.025 38.81 20.5 8.18 7.44 73.66 62761
1571
28 7.62 16.33 66.6
2
1650
水樣一 9 29
2.79 1.018 29.02 19.2 7.93 5.02 61.66 49198
10 30.1 4.45 1.018 29.42 15.6 7.12 4.98 58.32 49252
1054
1430
8 30.29 8.45 1.023 34.79
RESULTS
Table 1.安平港水質結果
溫度 ( ℃) 濁度 (NTU) 比重 鹽度 (ppt) 透視度 (15cm) PH (7.5-8.5) DO (>5.0mg/l) TDS (56 ms / cm) EC 48,000uS ~
50,000uS(26 ℃) COD (mg/l)
8 31.56 9.07 1.022 35.61
TDH & TRH
• 通常致病性腸炎弧菌都會具有的致病因子
• TDH: • TRH:
L-GGTACTAAATGGCTGACATC R-CCACTACCACTCTCATATGC
L-GGCTCAAAATGGTTAAGCG R-CATTTCCGCTCTCATATGC
(Applied and Environmental Microbiology, Nov. 2004, P.6401-6406)
Studies on vibrio parahaemolyticus by PCR during
the four seasons in the south coast of taiwan
指導老師:張福林副教授 研究生:陳念群
Introduction
致病三大弧菌
V.vulnificus V.cholerae V. parahaemolyticus
8 29 3.19 1.021 33.04 20.4 8.27 4.61 72.86 57814
水樣三 9 29
39.4 1.024 37.05 10.2 8.16 5.89 73.7 56594
10 30.2 2.27 1.024 37.47 22 8.17 6.3 71.58 59572
over
研究架構
海水、有機樣本收集 (水質測量)
傳統方法培養 腸炎弧菌
利用腸炎弧菌ToxR基因專一性 引子進行最確數-聚合酵素連鎖 反應(MPN-PCR),偵測樣本中全
部的腸炎弧菌密度
利用PCR偵測樣本中 致病性腸炎弧菌(tdh/ trh)及分析KP和 血清型
數據整理與分析
採樣地點
安平漁 港
興達漁 港
前鎮漁 港
over
8 29 4.37 1.021 33.04 19.2 8.27 5.17 72.48 58068
水樣二 9 29
18.4 1.024 37.05
10 8.14 6.66 73.92 56673
10 30.2 2.53 1.023 36.13 27.6 8.23 6.34 72.92 61029
兩者在生化試驗上的區別:TCBS及嗜鹽性試驗
• TCBS
V. parahaemolyticus : 直徑1~2mm、有光澤、綠色
V. cholerae : 直徑2~4mm 、平滑、黃色、中心不透明、周圍透
明
• 嗜鹽性試驗(0% 、 1% 、 6% 、 8% 、 10%)
V. parahaemolyticus : 6% 、 8%生長良好
就是致病菌株 .
命名系
• （一）方式：
統
西元年/月/地點/樣本編號/菌株編號
• （二）說明：
西元年2005 →取後二碼 05
月份：01、02、03、04、05、06、07、08、09、10、11、12
地點：安平港→A
興:
• 菌株編號：自01開始編號 • 例如 : 0508A1302
EC 48,000uS ~ 50,000uS(26℃) COD (mg/l)
8 28 20.6 1.014 23.26 17.2 6.89 6.36 45.28 35046
1384
水樣一 9 30
2.92 1.022 34.79
25 7.84 6.02 67.1 51086
10 31.1 5.72 1.023 36.55 26.8 8.02 6.15 70.74 59923
1590
1605
1598
over
1346
1678
Table 3.前鎮港水質結果
溫度 ( ℃) 濁度 (NTU) 比重 鹽度 (ppt) 透視度 (15cm) PH (7.5-8.5) DO (>5.0mg/l) TDS (56 ms / cm)
EC 48,000uS ~ 50,000uS(26℃) COD (mg/l)
toxR(+)
PCR (toxR)
菌體抗原
致病性分析 生化鑑定
PCR (tdh) KP試驗 PCR (trh)
toxR
• 對腸炎弧菌的專一性非 常強
• L-GTCTTCTGACGCAATCGTTG R-ATACGAGTGGTTGCTGTCATG
•(JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY,Apr. 1999, p. 1173–1177)
• 霍亂弧菌與腸炎弧菌是食品界及 防疫單位最重視的食品中毒菌
(資料來源:行政院衛生署)
V. parahaemolyticus 1950年首次發現
H、O、K
V.cholerae 1854年首次發現 01群(稻葉型霍亂弧菌及小川型霍亂弧菌)
及
非01群(0-139 霍亂弧菌 )
Thermostable direct hemolysin (TDH)
• Pathogenic V.parahaemolyticus generally
produces a thermostable direct hemolysin (TDH).
• More than 90% of clinical
V.parahaemolyticus isolates, but fewer
水樣三 9 29
2.74 1.019 30.37 22.4 7.94 4.93 61.42 48866
10 30.1 2.77 1.021 33.46 22 7.85 4.31 69.7 58613
1647
710
1563
1737
1036
1607
Table 2.興達港水質結果
溫度 ( ℃) 濁度 (NTU) 比重 鹽度 (ppt) 透視度 (15cm) PH (7.5-8.5) DO (>5.0mg/l) TDS (56 ms / cm)
25 8.38 10.06 71.14 56825
水樣二 9 29
2.82 1.018 29.02 14.2 7.93 5.73 60.98 48285
10 30.1 4.04 1.017 28.07 13 7.76 5.94 56.46 47155
8 31.86 4.45 1.019 31.58 23.1 7.58 7.49 60.66 52597
Sample collection (3水樣3有機樣本)
APW
每管APW各取1loop接種於TCBS
抽取DNA
挑選典型綠色菌落分別各接種於TSB-2及TSA-2
PCR(toxR)
由TSB-2 抽取DNA
toxR(+): PCR (tdh) PCR (trh)
toxR(-): PCR (16S rRNA)
16S rRNA
• 所有的菌都具有16s rRNA ,於是選擇保守的序列來做為primer ,這樣就可知 道樣本中的DNA是否有毀損.
• L-ACGGCGCAGACTCCTACGGGAGGC R-GGGTTGCGCTCGTTGCGGCACTTA
(Journal of Clinical Microbiology, Aug. 1994, P.1911-1917)
cholera toxin ( CT )
水（為主），食物及生活接觸
水（為主），食物及生活接觸
2-48小時的潛伏期
24-48小時的潛伏期
會伴隨輕度發燒
病人通常不會發燒
呈水性且黏液狀、15%之患者含血便 有時有些黏液，不含血便，略帶甜味似 洗米過後的水
不會有低血壓
低血壓
攝氏75度時，15分鐘以上
攝氏100度時，3分鐘
採樣方法
• 水樣:利用採樣筒丟入海水中採得水樣後放入 無菌塑膠試管中
• 有機物質:刮取岸邊岩石上的藻類、貝類或水 中魚類後放入無菌塑膠試管中
• 保存於室溫3小時內帶回實驗室分析
水質測量
• PH (METTLER TOLEDO) • 比重 • 鹽度 • 溫度 (VWR 1551-004) • 透視度 • 濁度 (HACH 46500-00) • 綜合水質DO、TDS、 EC (DR/2500 Prot HACH5900) • COD (HACH COD Reactor) 、 (HACH ODYSSEY)
8 28.5 1.7 1.021 33.04 27.2 7.08 6.49 63.44 48920
水樣三 9 30
1.17 1.023 36.13 26.6 7.89 5.28 73.32 55932
10 30.8 1.84 1.025 39.23 10.8 7.94 5.24 74.2 61852
可生長
混濁 黃色 紅色
負反應
紅色 紅色 斷裂 非黑色 澄清狀 陰性 不生長 不生長 非深紫色 原色 黃色 黃色 不生長或緩慢
不生長或緩慢
澄清 紫色 原色
腸炎弧菌的反應
－ ＋ － － ＋ － ＋ － ＋ － － ＋ －
＋
＋ ＋ －
KP
•使用 Wagatsuma agar 加以培養，若有 β溶 血 ( 在培養基上形成透明圈 ) 現象則稱為 Kanagawa phenomenon ( KP 陽性 )，很可能