巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统综述
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毕赤酵母开发利用历史
1969年,koichi Ogata首次报道了某些酵母菌能够利用甲醇作为 唯一碳源和能源,七十年代美国 Philips Petroleum Company成 功开发了廉价的培养基和高细胞密度方法培养甲醇营养型巴斯 德毕赤酵母(Pichia pastoris)生产单细胞蛋白作为饲料。 八十年代,Philips Petroleum Company与Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc.(SIBIA, La Jolla, CA)开 始联合开发毕赤酵母系统。1985年SIBIA公司的研究人员Ellis 等首次成功分离了甲醇氧化酶基因及其启动子。同年,Cregg 等报道了巴斯德毕赤酵母作为宿主成功表达外源蛋白。 1993年,Philip Petroleum公司将毕赤酵母表达系统的专利卖给 Research Corporation Technologies公司,并委托Invitrogea公司 进行有关产品销售。 目前毕赤酵母已成功应用于400多种外源蛋白的表达。
1 补料(碳源、氮源)策略的影响 在以AOX酶启动子控制的基因工程菌毕赤酵母表 达外源蛋白培养过程中,甲醇被用来外源蛋白表 达的诱导物和细胞生长的碳源。决定外源蛋白的 产量和产率最重要的参数是甲醇浓度 对于培养 时甲醇的含量,不同的表型甲醇的利用速率不同, 一般的经验是甲醇含量不超过5g/L时不会对毕赤 酵母细胞造成毒害。在诱导时,一般都要经过一 个甲醇利用适应期,随后进入甲醇快速的稳定期。 对甲醇流加量的控制最好是 通过在线检测来实 现。
毕赤酵母的优点
利用受甲醇诱导的醇氧化酶(AOX1)启动子,可严格 控制外源基因的表达
营养要求简单,生长快速,适合高密度大规模培养, 很少产生有毒物质,毒性比细菌小,用甲醇不易染菌, 可以减少污染。 外源蛋白基因遗传高稳定性,外源蛋白质具有一定程 度上的折叠加工和糖基化修饰,性质较原核表达的蛋 白质更加稳定,特别适合于表达真核生物基因和制备 有功能的蛋白质。
毕赤酵母启动子以及诱导物
启动子 诱导表达 AOX1,AOX2(甲醇氧化酶) 以甲醇诱导表达 GAP (3 一磷酸甘油醛脱氢酶) 葡萄糖组成型 表达(甘油或甲醇诱导产量只有2/3,1/3) FLD1(甲醛脱氢酶) 以甲基化胺为氮源 (葡萄 糖为碳源),甲醇为碳源 (硫酸铵为氮源)表达 PEX8(过氧化物酶体基质蛋白) 以葡萄糖、 甲醇诱导表达 YPT1(GTP酶) 以葡萄糖甲醇、甘露糖醇组 成型表达
酿酒酵母优缺点
优点
不产生毒素,遗传背景清楚,安全性好, 易进行 操作 酿酒酵母是真核生物, 可以对蛋白进行翻译后加 工。 表达产物可分泌表达, 易于纯化。 酿酒酵母生长迅速, 工艺简单, 成本低。
缺点
对真核基因产物的翻译后加工与高等真核生物有 所不同, 重组蛋白常发生超糖基化。 酿酒酵母不易进行高密度发酵, 表达产物产量低。 分泌效率低, >30kD的蛋白质几乎不分泌。 该表达系统质粒易丢失, 传代不稳定。
(2)甲醇营养型酵母表达系统 甲醇营养型酵母包括汉逊酵母属(Hansenula),毕 赤酵母属(Pichia),球拟酵母属(Torulopsis)等,能 在以甲醇为唯一能源和碳源的培养基上生长,甲 醇可以诱导它们表达甲醇代谢所需的酶,如醇氧 化酶I(AOX1), 二羟丙酮合成酶(DHAS)、甲酸 脱氢酶(FMD)等。 AOX1的甲醇诱导表达量可占 胞内总蛋白质的20%-30%,表明AOX1 的合成 受转录水平的调控。AOX1 启动子(PAox )具有较 高的调控功能,可用于外源基因的表达调控。甲 醇营养型酵母表达系统以巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统最为常用。
5 减少外源蛋白的降解 调节溶解氧、氨、添加维生素,酪蛋白氨基 酸水解物,氨基酸,脂肪酸或蛋白胨等来作 为蛋白酶的底物从而减少对产物的降解 使用蛋白酶缺陷型宿主
6 无机盐的影响]Qgg P.pastoris生长及 表达时所需的无机盐有Fe2+(Fe3+)、 Cu2+、Zn2+、Mg2+、Mn2+、Ca2+等, 这些离子对表达外源蛋白尤其重要,一 旦失去Ca2+等离子重组外源蛋白表达量 显著减少,甚至于P.pastoris的生长都受 到极大的影响。
几种常用酵母表达系统
(1)酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达系统
作为真核生物的模式菌, 酿酒酵母是目前了解最完全 的真核生物, 其全序列的测定已于 1996年完成 。 酿酒酵母难于高密度培养,分泌效率低,几乎不分泌分 子量大于30 kD 的外源蛋白质,也不能使所表达的外源 蛋白质正确糖基化,而且表达蛋白质的C 端往往被截短。 因此,一般不用酿酒酵母做重组蛋白质表达的宿主菌。 酿酒酵母本身含有质粒,其表达载体可以有自主复制型 和整合型两种。值得注意的是,酿酒酵母表达的外源蛋 白质往往被高度糖基化,糖链上可以带有40 个以上的 甘露糖残基,糖蛋白的核心寡聚糖链仅含有末端1, 3 甘 露糖,产物的抗原性明显增强。所以,酿酒酵母常常用 来制备亚单位疫苗(如默克乙肝疫苗、口蹄疫疫苗等)。
4 溶解氧DO的影响 P.pastoris是好氧微生物,它的生长代谢过程需要 氧气的参与,充足的氧气是P.pastoris高效表达所 必需的,溶解氧浓度对菌体的生长和产物生成的 影响很大,溶解氧的浓度过高或过低都会影响酵 母的代谢,使后期的生长变得极为缓慢。一般要 求溶氧(DO)最好处在30%~60%之间。当DO过低 时,P.pastoris便会产生乙醇或乙酸,抑制外源蛋 白的表达。菌体在大量扩增过程中,耗氧进行氧 化分解代谢,饱和氧的及时供给非常重要
巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)表达系统
巴斯德毕赤酵母是甲醇营养型酵母中的一类能够利 用甲醇作为唯一碳源和能源的酵母菌。
酵母菌的形态
毕赤酵母发酵培养形态
毕赤酵母-概述
它是在无性生长期主要以单倍体形式存在,当环境营养限制 时,常诱导2个生理类型不同的接合型单倍体细胞交配,融合 成双倍体。 巴斯德毕赤酵母的另一个生物学特点是,甲醇代谢所需的醇 氧化酶被分选到过氧化物酶体中,形成区域化。以葡萄糖作 碳源时,菌体中只有1个或很少几个小的过氧化物酶体,而以 甲醇作碳源时,过氧化物酶体几乎占到整个细胞体积80%, AOX增至细胞总蛋白的35%-40%。因此,当在AOX基因前利 用同源重组方式插入外源蛋白基因时,可获得大量表达。同 时,根据甲醇酵母这种可以形成过氧化物酶体的特性,既可 利用该系统表达一些毒性蛋白和易被降解的酶类,也可用以 研究细胞特异区域化的生物发生及其机制和功能,为高等动 物类似的研究提供启示
毕赤酵母发酵工艺对产量的影响
Fra Baidu bibliotek
甲醇营养型毕赤酵母表达外源蛋白发酵一般有二个阶 段,即酵母细胞营养生长阶段和外源蛋白表达阶段。 酵母细胞生长阶段主要目的为达到一定的菌体量,另 一方面通过流加限制甘油来抑制甲醇代谢途径,并使 细胞从甘油相顺利向甲醇相过渡。 蛋白表达阶段由于毕赤酵母具有以甲酵作为唯一碳源 和能源的特性,且外源基因就插入在能够利用甲醇的 AOX基因中,当甘油用完时立刻补入甲醇诱导AOX基 因产生醇氧化酶来利用甲醇,同时启动表达外源基因 的AOX的启动子(PAOX)表达外源基因蛋白
3、哺乳动物细胞表达系统 生产的蛋白具有天然构象,稳定性好, 糖基化模式没有发生改变,但哺乳动物 细胞培养成本高,条件要求严格,蛋白 表达水平较低。
4、酵母表达系统 酵母是低等真核生物,具有细胞生长快, 易于培养,遗传操作简单等原核生物的 特点,又具有真核生物对表达的蛋白质 进行正确加工,修饰,合理的空间折叠 等功能,非常有利于真核基因的表达, 能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译 后加工、修饰等不足.
表达效率高,外源蛋白分泌高,产物易于纯化
毕赤酵母的缺点
发酵周期长,甲醇易燃易爆有毒,存在 一定的危险性。
产物蛋白质可能出现不均一、信号肽加 工不完全、内部降解、多聚体形成等, 造成表达蛋白质在结构上的不一致。时 常遇到表达产物的过度糖基化情况
重组毕赤酵母的表型
毕赤酵母工程菌株有Y11430,MG1003,GS115 (AOX1), KM71,SMD1168 根据利用甲醇的能力 , 可将巴斯德毕赤酵母分成三型 Mut+ :毕赤酵母具有完整的AOX1 和 AOX2 基因 , 能够在甲醇 中以野生型速率生长 , 为甲醇快利用型如GS115 , 绝大多数毕赤 酵母为 Mut+表型。 Muts : 此型毕赤酵母 , 如 KM71的 AOX1 基因部分敲除 ,被酿 酒酵母ARG4 基因所取代 , 菌细胞可依赖 AOX2基因编码的少 量醇氧化酶完成甲醇代谢 , 因此在甲醇培养基中生长缓慢 , 胞内 表达尽量选择muts。 即 Mut-型 , 此型毕赤酵母 AOX1 及 AOX2 基因均被敲除 ,菌细 胞不能进行甲醇代谢 , 无法在甲醇中生长 ,为甲醇不利用型。
外源蛋白在巴斯德毕赤酵母中的 表达种类
具有代表性的如下列一些外源蛋白质P.pastoris中已经获得高效产 生: (1)蛋白酶类,如人溶菌酶、人胃促胰酶、葡萄糖苷酶等; (2)激素类,如胰岛素前体、人绒毛膜促性腺激素、鲤鱼生长激 素等; (3)受体、抗体及单链抗体等生物活性蛋白; (4)抗原类,如乙型肝炎表面抗原、破伤风毒素片段C、登革热病 毒E蛋白等; (5)细胞因子类,如肿瘤坏死因子、表皮生长因子、血管生成抑制 因子等; (6)酶制剂类,如植酸酶等; (7)病毒蛋白类,如乙型脑炎病毒E蛋白、伪狂犬病病毒Ea株gE蛋 白等
(3)裂殖酵母(Schizogenesis
pombe)
表达系统
只能以分裂和产孢子的方式繁殖的一类酵母, 因此定名为裂殖酵母。与前面几种酵母相比, 它具有更多的与高等真核生物相似的特性: 线 粒体结构、 启动子结构、 转录机制和对蛋白2端 酰基化功能均更接近于哺乳类细胞, 因而正逐 渐成为研究真核细胞分子生物学的模式生物, 它作为外源基因表达系统也开始受到人们的关注。 目前, 已经有多种蛋白利用此系统进行了表达, 如人蛋白凝血因子)G、 细胞色素 V6:8、 人白细 胞介素 YL’D等。此系统表达的外源蛋白更接近 于它们的天然形式 。
3 温度的影响 温度对P.pastoris菌体的生长和发酵的影响是各 种因素综合表现的结果。酵母细胞生长时温度 一般为25~30℃, 28℃是酵母菌体生长的最适 温度,而在表达时温度应稍低些,如果温度过 高,细胞生长和表达外源蛋白将受到抑制,并 且色素增加;如果温度超过32℃,对蛋白表达 不利,甚至会导致细胞死亡。如果温度过低, 因而培养开支要增大,且复杂的操作要增加; 温度越高,酶的失活也越快,表现在菌体易于 衰老,发酵周期缩短,影响产物的产量。
酵母作为外源基因表达系统与其 他系统的比较
1、大肠杆菌系统 具有产量高、成本低、生产周期短的特 点,但胞内高水平表达的外源蛋白大多 以不溶解、无活性的包涵体形式存在, 而目前由包涵体中提取高水平、高比活 的目标蛋白的最大问题是回收率极低, 大部分目标蛋白在复性过程中析出丢失。
2、杆状病毒系统 采用先瞬时感染,然后裂解感染昆虫细 胞的方式产生重组蛋白,此系统表达的 蛋白折叠正确且被糖基化修饰,但有时 糖基化序列与天然的不同,且蛋白产量 不稳定。
2 pH值的影响 通常P.pastoris可在pH为3.0-7.0范围内生长,当 pH低于2.2时菌体停止生长, 最适生长pH为4.85.5,实际操作中应根据需要可以选择不同的pH 值。一般诱导表达时pH为6.0,生长期pH为5.0。 有时为了在生长初期防止染菌,一般采取较低 的pH进行发酵。另外,为了防止表达蛋白的降 解,可以降低或者升高培养时的pH。因此,必 须选择合适的pH值,既可以高效表达目的蛋白 又能抑制蛋白酶的水解,保持目的蛋白的稳定 性。尽管毕赤酵母生长的pH值范围比较宽,但 是具体到不同的重组工程菌,就各有不同的最 适生长pH值。