枯草芽孢杆菌
合集下载
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
8
构建芽孢杆菌标准化质粒
为了使枯草芽孢杆菌满足合成生物学模式生物的要求，核心就是构建模块化的标准。这倒
也不是很困难，只需要将大肠杆菌的基因零件标准在枯草芽孢杆菌的质粒上重构一下就可 以了，枯草芽孢杆菌质粒与大肠杆菌不同之处是存在基因组整合位点，将这个位点引入还
有零件标准的质粒中，就构建成了枯草芽孢杆菌标准化质粒了。
营养周期与大肠杆菌非常相似。然而，在 诸如饥饿等压力源的情况下，细胞进入孢 子形成，首先进行极细胞分裂，然后形成 内生孢子。如果环境条件再次合适，则孢 子会发芽并重新进入营养循环。
4
芽孢杆菌的分化
枯草芽孢杆菌的自然栖息地是土壤，被迫适应许多环
境变化。因此，枯草芽孢杆菌的特征在于快速和狡猾 的反射和复杂的生活方式。由于其天然的能力，它可
10
载体的整合机制
它们都通过在特定位点的双重同源 重组插入到基因组中。因此，枯草 芽孢杆菌中的靶基因被破坏，可以 通过特定的检测来选择。
11
启动子的评估方式
01
发光测量
02
β-半乳糖苷酶测 定
12
三组启动子的评估
一，安德森系列启动子评估 它们已经在大肠杆菌中被广泛测量，在枯草芽孢杆菌中测定了11只安德森启动子，并显示相对较弱的 活性。 二，组成型芽孢杆菌启动子
9
创建B 4 - 22核心部分
引入枯草芽孢杆菌作为基于BioBrick的合成生物学的新孢杆菌的特定部分 Vertors（载体） promoters（启动子） reporters（通讯员） affinity tags（亲和标签） 我们所有的标签都是由GeneArt合成的。我们的亲和标签还未验证。
17
实验中过滤器的问题
过滤器问题过滤器广泛应用于日常生活和实验室。过滤器，例如用于 从饮用水和管道系统中去除钙和其他污染物的Brita过滤器是丰富的。 在实验室中，过滤器（通常称为柱）用于DNA /蛋白质纯化和蛋白质表 征。这种过滤器通常由填充有某种类型的矩阵的盒组成。为了使表面 最小化，微珠通常用于所有类型的过滤器。这些珠具有特定的尺寸， 例如可用于在其表面上显示蛋白质。蛋白质与珠子的偶联是基于亲和
20
基因敲除
我们关于如何防止发芽发生的想法是敲除编码发芽过程中涉及的功能的基因。有大量的基因 在萌发中发挥作用，但我们的目标是选择一些非常重要的基因敲除。
基于他人的研究，我们选择的基因是cwlJ， sleB， cwlB， gerD和 cwlD。显示：cwlJ 和 sleB：一起敲除时，发芽频率降低5个数量级。两种基因都代表了在发芽过程中有活性的溶 酶。gerD 和 cwlB：一起敲除时，发芽频率降低5个数量级。该 GERD产品起着营养发芽未 知的作用; cwlB的产物在细胞壁周转和细胞裂解中起作用。注：在多次尝试后淘汰 cwlB，并 产生以非常缓慢的速度生长的细胞无法生长或细胞，我们决定淘汰 cwlB不妥当生产的孢粉珠， 因为这将延迟在所有实验发芽停止模块。cwlD：当被淘汰时，发芽率为0.003至0.05％。该 基因编码由发芽特异性皮质裂解酶切割的识别组分。通过敲除所有这五个基因，我们的目标 是产生 枯草芽孢杆菌 菌株，其产生完全不能发芽的孢子。在孢子破坏过程中，发芽停止。 没有裂解酶分解外套，孢子应该不能超过营养阶段。
以占据外源DNA并将其整合到其基因组中。灵活应
对环境，转向营养或避免有毒物质，它的活动是借助 其鞭毛。如果饥饿，一些细胞甚至成为食人兄弟姐妹。 如果条件对于生存来说太糟糕了， 枯草芽孢杆菌可 以形成内生孢子。这些是非常休眠和高度稳定的阶段， 耐干燥，紫外线，热和压力。一旦这些孢子遇到更好 在枯草芽孢杆菌群落中区分不同细胞类型的示意图 的条件，他们才能再次发芽。
构建了三种新的枯草芽孢杆菌启动子（P liaG，P veg，P lepA）PliaG该启动子显示比Anderson启动子
高得多的活性，但与其他评估的芽孢杆菌启动子相比仍然相对较弱。Pveg这个推动者是我们评估中最强 的。PlepA该启动子的活性在最强的芽孢杆菌启动子P veg的活性和弱P liaG之间。
15
枯草芽孢杆菌会形成芽孢
芽孢是细菌在逆境中形成的一种致密结构，可以抵抗高低温、缺氧、缺水等
一系列不良环境，又可以在良好的环境中重新萌发为完整的菌体。
由于芽孢超强的稳定性，有很多潜在的应用可以被开发，比如用来作为蛋白
质或其他物质的呈递装置应用在过滤柱中，应用在很多需要进行“过滤”的 领域，过滤其实是个挺复杂的事情，并不只是我们日常生活中过滤杂质这么 简单。举个例子，海水淡化其实主要就是过滤海水中的阳离子，非常困难的。
另外，由于枯草芽孢杆菌本来的生活环境是在土壤中，它必须时刻准备应对
环境的变化，于是枯草芽孢杆菌进化出了一种分化机制，可以根据外界环境 分化为不同的性状，这就为潜在的多种应用提供了基础。
16
bead zillus：为基本生物砖枯草芽孢杆菌和孢子的蛋白质展示的平台
我们选择使用枯草芽孢杆菌来设计新的视野，并为这种模型生物提供工具，用于大肠杆菌 的iGEM世界。因此，我们在BioBrick标准中创建了由定义的启动子以及报告基因，表达和 空载体组成的芽孢杆菌 B io B rick B ox（B 4—22）。枯草芽孢杆菌天然产生耐应力的内生 孢子，其可以根据合适的环境条件发芽。为了突出使用这种独特的功能，我们开发Sporo beads。这些是表面融合蛋白的孢子。我们将GFP（绿色荧光蛋白）融合到最外层。扩大 这个想法，我们设计了一个孢粉矢量可以轻松地创建任何孢粉珠。为了保证孢粉珠的安全， 我们通过敲除基因参与防止发芽，并制定了自杀开关在发芽的情况下接通。随着项目Bead zillus，我们的团队展示了枯草芽孢杆菌的强大性质。
21
自杀开关
作为一个备份计划，以使我们的孢粉珠更安全，我们开发了自杀开关。在孢子发芽的情况下，由于降 解或它们的外涂层，例如，通过高压的破坏，自杀开关将被接通。
我们利用替代和异源σ因子和目标启动子。两者都是不存在于枯草芽孢杆菌，并因此不被任何其他因 数σ识别枯草芽孢杆菌。 替代σ因子ecf41 比里aa1-204，其从派生地衣芽孢杆菌组成的截短的版本“ON”是合成链接到二分 之一的σ ģ调控的启动子强烈响应或P SSPK弱响应。σ G ^是在forespore激活最后σ因子。因此， Ecf41 Bli aa1-204生产相当晚，只在前景中。Ecf41 Bli aa1-204然后激活其独特的目标启动子P ydfG。 该启动子与MazF融合。因此，P ydfG的激活导致MazF（一种来自大肠杆菌降解mRNA 的细菌毒素） 的表达。 所产生的时间过程如下：Sporo 珠的孢子通过P spoIVB或P sspK的激活导致在分化周期结束时在前 孢子中产生Ecf41 Bli aa1-204。随后，由于P ydfG的激活，这将导致MazF的表达。对于我们已经成 熟的Sporo珠，这不会有毒，因为它们代表不需要翻译的休眠状态。但是，在一个情况下孢粉珠逸出 的萌发基于上述基因敲除STOP
枯草芽孢杆菌
Bacillus Subtilis
陈家馨 王玲玲 沈嘉妮
目
Contents
1
介绍枯草芽孢杆菌
录
2
为什么选择枯草芽孢杆菌
3
建立beadzillus开发Sporo beads
4
Sporo beads是什么
5
Sporo beads的应用
2
枯草芽孢杆菌
枯草芽孢杆菌，芽孢杆菌属的一种。
因为易在枯草浸液中繁殖，所以人
5
模式生物需要满足的条件
01
易于培养和进行 遗传操作
02
标准化质粒原件 和相应的基因改 造方法
03
安全性
6
枯草芽孢杆菌革兰氏阳性菌
迄今为止大部分的合成生物学操作都是基于大肠杆菌（Escherichia coli）的，大肠杆菌是
一种革兰氏阴性菌。革兰氏阳性菌具有革兰氏阴性菌不具有的一些优势，比如：革兰氏阳性
之后，慕尼黑大学构建了一系列适用于芽孢杆菌的启动子，包括常规表达的启动子和诱导 表达的启动子。另外，他们还测试了常用的报告基因在这个质粒系统中的表达情况，这些 报告基因都针对枯草芽孢杆菌进行了密码子优化（Coden Optimization）。这些报告基因 包括绿色荧光蛋白、lacZ、荧光素酶。最后，他们测试了常用的蛋白纯化标签在枯草芽孢 杆菌中的作用。这些工作并没有什么出彩之处，因为他们的正常工作早已经被验证过。 有了标准化质粒、启动子、终止子、报告基因和纯化标签，一个合成生物学模式生物就基 本上建立了。
物学的解决方案bead zillus，其中生物珠显示所选择的蛋白质。我们 称这些生物珠孢粉珠。
18
孢粉珠是什么
孢粉珠是以可以用作个体蛋白质显示的平台的方式修饰的枯草芽孢杆菌孢子。
该模块的目的是创建在其表面上显示融合蛋白的这些孢子。有几种不同的蛋 白质形成枯草芽孢杆菌孢子的孢子层。最外层，即所谓的孢子，由两种蛋白
P XYL - xylR是从木糖诱导启动子枯草芽孢杆菌。对于这种启动子，我们尚未成功克隆到报告载体中以评
价活性。
13
三，诱导性芽胞杆菌启动子 启动子的最后一组包括来自两个诱导型启动子的枯草芽孢杆菌，P LIAI和xylR -P XYL。一种新的抗生素 诱导的启动子P lial其响应于干扰细胞壁的完整性和生物合成的抗生素。在刺激的情况下，双组分系统 LiaRS被激活。活化的响应调节剂LiaR与启动子的操纵子结合并诱导ia基因座的转录。当启动子启动时， 表达了两种蛋白质LiaI和LiaH。该启动子的主要优点是在不存在诱导物及其高动态范围的情况下具有非 常低的基础活性。用不同浓度的杆菌肽测量诱导，证明在大范围的启动子活性中具有浓度依赖性反应。
14
芽孢杆菌通讯员的选择
萤火虫萤光素酶是迄今为止最常用的生物发光通讯员。天然萤火虫荧光素酶作为遗传报告基因的普及 是由于酶测定的灵敏度和方便性以及蛋白质合成与酶活性的紧密耦合。由luc基因编码的萤火虫荧光 素酶是不需要任何翻译后修饰的单体; 它可以作为成熟酶直接在其mRNA翻译中获得。从核糖体释放 后立即获得催化能力。此外，荧光素酶在细胞中的半衰期非常短（约3小时）。综合起来，这些性质 使荧光素酶成为一个非常敏感的通讯员，远远超过其他常用的通讯员。
力结合。例如可用于结合含有His标签的蛋白质的Ni-NTA树脂（或珠
粒）。如果蛋白质以这种方式结合到珠粒上，则其特征然后确定这种 负载蛋白质的珠粒的功能特性。 这样的珠通常是相当昂贵的，蛋白质 与珠子的偶联是费力的，因为蛋白质必须被表达，结合到珠子上然后
洗涤。为了解决这个问题，我们已经开发出在我们的项目中的合成生
质CotZ和CgeA组成。这就是为什么我们用它们来创建我们要表达功能融合
蛋白孢粉珠。
19
保证孢粉珠的安全
基因敲除
我们选择了重要的发芽基因并将其敲除。随后，我们将单个突变体组合成四倍体突变体， 并成功地防止了萌发。
自杀开关
在发芽基因敲除失败的情况下，我们发明了自杀开关。如果孢子仍然发芽，毒素的产生将 导致立即的细胞死亡。
菌有天然的外源基因摄入和整合入基因组的机制，这种机制为遗传操作提供了方便；革兰氏 阳性菌的分泌机制比较完善，蛋白质表达后可以很好地分泌到细胞外，而这正是革兰氏阴性
菌在异源蛋白表达时面临的最大问题。
7
枯草芽孢杆菌的转化
枯草芽孢杆菌可以复制大肠杆菌的质粒，但是有一种更优雅的方
式引入外源DNA片段。当侧面与枯草芽孢杆菌基因组同源时，将 通过在该基因座处的同源重组以高效率整合，随后用染色体复制。 这导致稳定的单拷贝基因组改变，从而避免使用复制质粒发生的 拷贝数伪影。这种不同的基因操作的方式需要使用整合载体，如 通过我们提供B4-22。因此，枯草芽孢杆菌是合成生物学的理想 遗传平台。
们取名枯草芽孢杆菌。革兰氏阳性
菌，菌落表面粗糙不透明，污白色
或微黄色，在液体培养基中生长时，
常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白
质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形
成吲哚。
3
枯草芽孢杆菌的生命周期和不同的细胞阶段。
枯草芽孢杆菌能够分化成具有不同形态和功能的细胞。最特征的形式是在营养不足的情况下产生 的内生孢子。在我们的项目中，我们利用了内生孢子的生产。因为它们是极其稳定的，孢子是用 于功能性融合蛋白的。
构建芽孢杆菌标准化质粒
为了使枯草芽孢杆菌满足合成生物学模式生物的要求，核心就是构建模块化的标准。这倒
也不是很困难，只需要将大肠杆菌的基因零件标准在枯草芽孢杆菌的质粒上重构一下就可 以了，枯草芽孢杆菌质粒与大肠杆菌不同之处是存在基因组整合位点，将这个位点引入还
有零件标准的质粒中，就构建成了枯草芽孢杆菌标准化质粒了。
营养周期与大肠杆菌非常相似。然而，在 诸如饥饿等压力源的情况下，细胞进入孢 子形成，首先进行极细胞分裂，然后形成 内生孢子。如果环境条件再次合适，则孢 子会发芽并重新进入营养循环。
4
芽孢杆菌的分化
枯草芽孢杆菌的自然栖息地是土壤，被迫适应许多环
境变化。因此，枯草芽孢杆菌的特征在于快速和狡猾 的反射和复杂的生活方式。由于其天然的能力，它可
10
载体的整合机制
它们都通过在特定位点的双重同源 重组插入到基因组中。因此，枯草 芽孢杆菌中的靶基因被破坏，可以 通过特定的检测来选择。
11
启动子的评估方式
01
发光测量
02
β-半乳糖苷酶测 定
12
三组启动子的评估
一，安德森系列启动子评估 它们已经在大肠杆菌中被广泛测量，在枯草芽孢杆菌中测定了11只安德森启动子，并显示相对较弱的 活性。 二，组成型芽孢杆菌启动子
9
创建B 4 - 22核心部分
引入枯草芽孢杆菌作为基于BioBrick的合成生物学的新孢杆菌的特定部分 Vertors（载体） promoters（启动子） reporters（通讯员） affinity tags（亲和标签） 我们所有的标签都是由GeneArt合成的。我们的亲和标签还未验证。
17
实验中过滤器的问题
过滤器问题过滤器广泛应用于日常生活和实验室。过滤器，例如用于 从饮用水和管道系统中去除钙和其他污染物的Brita过滤器是丰富的。 在实验室中，过滤器（通常称为柱）用于DNA /蛋白质纯化和蛋白质表 征。这种过滤器通常由填充有某种类型的矩阵的盒组成。为了使表面 最小化，微珠通常用于所有类型的过滤器。这些珠具有特定的尺寸， 例如可用于在其表面上显示蛋白质。蛋白质与珠子的偶联是基于亲和
20
基因敲除
我们关于如何防止发芽发生的想法是敲除编码发芽过程中涉及的功能的基因。有大量的基因 在萌发中发挥作用，但我们的目标是选择一些非常重要的基因敲除。
基于他人的研究，我们选择的基因是cwlJ， sleB， cwlB， gerD和 cwlD。显示：cwlJ 和 sleB：一起敲除时，发芽频率降低5个数量级。两种基因都代表了在发芽过程中有活性的溶 酶。gerD 和 cwlB：一起敲除时，发芽频率降低5个数量级。该 GERD产品起着营养发芽未 知的作用; cwlB的产物在细胞壁周转和细胞裂解中起作用。注：在多次尝试后淘汰 cwlB，并 产生以非常缓慢的速度生长的细胞无法生长或细胞，我们决定淘汰 cwlB不妥当生产的孢粉珠， 因为这将延迟在所有实验发芽停止模块。cwlD：当被淘汰时，发芽率为0.003至0.05％。该 基因编码由发芽特异性皮质裂解酶切割的识别组分。通过敲除所有这五个基因，我们的目标 是产生 枯草芽孢杆菌 菌株，其产生完全不能发芽的孢子。在孢子破坏过程中，发芽停止。 没有裂解酶分解外套，孢子应该不能超过营养阶段。
以占据外源DNA并将其整合到其基因组中。灵活应
对环境，转向营养或避免有毒物质，它的活动是借助 其鞭毛。如果饥饿，一些细胞甚至成为食人兄弟姐妹。 如果条件对于生存来说太糟糕了， 枯草芽孢杆菌可 以形成内生孢子。这些是非常休眠和高度稳定的阶段， 耐干燥，紫外线，热和压力。一旦这些孢子遇到更好 在枯草芽孢杆菌群落中区分不同细胞类型的示意图 的条件，他们才能再次发芽。
构建了三种新的枯草芽孢杆菌启动子（P liaG，P veg，P lepA）PliaG该启动子显示比Anderson启动子
高得多的活性，但与其他评估的芽孢杆菌启动子相比仍然相对较弱。Pveg这个推动者是我们评估中最强 的。PlepA该启动子的活性在最强的芽孢杆菌启动子P veg的活性和弱P liaG之间。
15
枯草芽孢杆菌会形成芽孢
芽孢是细菌在逆境中形成的一种致密结构，可以抵抗高低温、缺氧、缺水等
一系列不良环境，又可以在良好的环境中重新萌发为完整的菌体。
由于芽孢超强的稳定性，有很多潜在的应用可以被开发，比如用来作为蛋白
质或其他物质的呈递装置应用在过滤柱中，应用在很多需要进行“过滤”的 领域，过滤其实是个挺复杂的事情，并不只是我们日常生活中过滤杂质这么 简单。举个例子，海水淡化其实主要就是过滤海水中的阳离子，非常困难的。
另外，由于枯草芽孢杆菌本来的生活环境是在土壤中，它必须时刻准备应对
环境的变化，于是枯草芽孢杆菌进化出了一种分化机制，可以根据外界环境 分化为不同的性状，这就为潜在的多种应用提供了基础。
16
bead zillus：为基本生物砖枯草芽孢杆菌和孢子的蛋白质展示的平台
我们选择使用枯草芽孢杆菌来设计新的视野，并为这种模型生物提供工具，用于大肠杆菌 的iGEM世界。因此，我们在BioBrick标准中创建了由定义的启动子以及报告基因，表达和 空载体组成的芽孢杆菌 B io B rick B ox（B 4—22）。枯草芽孢杆菌天然产生耐应力的内生 孢子，其可以根据合适的环境条件发芽。为了突出使用这种独特的功能，我们开发Sporo beads。这些是表面融合蛋白的孢子。我们将GFP（绿色荧光蛋白）融合到最外层。扩大 这个想法，我们设计了一个孢粉矢量可以轻松地创建任何孢粉珠。为了保证孢粉珠的安全， 我们通过敲除基因参与防止发芽，并制定了自杀开关在发芽的情况下接通。随着项目Bead zillus，我们的团队展示了枯草芽孢杆菌的强大性质。
21
自杀开关
作为一个备份计划，以使我们的孢粉珠更安全，我们开发了自杀开关。在孢子发芽的情况下，由于降 解或它们的外涂层，例如，通过高压的破坏，自杀开关将被接通。
我们利用替代和异源σ因子和目标启动子。两者都是不存在于枯草芽孢杆菌，并因此不被任何其他因 数σ识别枯草芽孢杆菌。 替代σ因子ecf41 比里aa1-204，其从派生地衣芽孢杆菌组成的截短的版本“ON”是合成链接到二分 之一的σ ģ调控的启动子强烈响应或P SSPK弱响应。σ G ^是在forespore激活最后σ因子。因此， Ecf41 Bli aa1-204生产相当晚，只在前景中。Ecf41 Bli aa1-204然后激活其独特的目标启动子P ydfG。 该启动子与MazF融合。因此，P ydfG的激活导致MazF（一种来自大肠杆菌降解mRNA 的细菌毒素） 的表达。 所产生的时间过程如下：Sporo 珠的孢子通过P spoIVB或P sspK的激活导致在分化周期结束时在前 孢子中产生Ecf41 Bli aa1-204。随后，由于P ydfG的激活，这将导致MazF的表达。对于我们已经成 熟的Sporo珠，这不会有毒，因为它们代表不需要翻译的休眠状态。但是，在一个情况下孢粉珠逸出 的萌发基于上述基因敲除STOP
枯草芽孢杆菌
Bacillus Subtilis
陈家馨 王玲玲 沈嘉妮
目
Contents
1
介绍枯草芽孢杆菌
录
2
为什么选择枯草芽孢杆菌
3
建立beadzillus开发Sporo beads
4
Sporo beads是什么
5
Sporo beads的应用
2
枯草芽孢杆菌
枯草芽孢杆菌，芽孢杆菌属的一种。
因为易在枯草浸液中繁殖，所以人
5
模式生物需要满足的条件
01
易于培养和进行 遗传操作
02
标准化质粒原件 和相应的基因改 造方法
03
安全性
6
枯草芽孢杆菌革兰氏阳性菌
迄今为止大部分的合成生物学操作都是基于大肠杆菌（Escherichia coli）的，大肠杆菌是
一种革兰氏阴性菌。革兰氏阳性菌具有革兰氏阴性菌不具有的一些优势，比如：革兰氏阳性
之后，慕尼黑大学构建了一系列适用于芽孢杆菌的启动子，包括常规表达的启动子和诱导 表达的启动子。另外，他们还测试了常用的报告基因在这个质粒系统中的表达情况，这些 报告基因都针对枯草芽孢杆菌进行了密码子优化（Coden Optimization）。这些报告基因 包括绿色荧光蛋白、lacZ、荧光素酶。最后，他们测试了常用的蛋白纯化标签在枯草芽孢 杆菌中的作用。这些工作并没有什么出彩之处，因为他们的正常工作早已经被验证过。 有了标准化质粒、启动子、终止子、报告基因和纯化标签，一个合成生物学模式生物就基 本上建立了。
物学的解决方案bead zillus，其中生物珠显示所选择的蛋白质。我们 称这些生物珠孢粉珠。
18
孢粉珠是什么
孢粉珠是以可以用作个体蛋白质显示的平台的方式修饰的枯草芽孢杆菌孢子。
该模块的目的是创建在其表面上显示融合蛋白的这些孢子。有几种不同的蛋 白质形成枯草芽孢杆菌孢子的孢子层。最外层，即所谓的孢子，由两种蛋白
P XYL - xylR是从木糖诱导启动子枯草芽孢杆菌。对于这种启动子，我们尚未成功克隆到报告载体中以评
价活性。
13
三，诱导性芽胞杆菌启动子 启动子的最后一组包括来自两个诱导型启动子的枯草芽孢杆菌，P LIAI和xylR -P XYL。一种新的抗生素 诱导的启动子P lial其响应于干扰细胞壁的完整性和生物合成的抗生素。在刺激的情况下，双组分系统 LiaRS被激活。活化的响应调节剂LiaR与启动子的操纵子结合并诱导ia基因座的转录。当启动子启动时， 表达了两种蛋白质LiaI和LiaH。该启动子的主要优点是在不存在诱导物及其高动态范围的情况下具有非 常低的基础活性。用不同浓度的杆菌肽测量诱导，证明在大范围的启动子活性中具有浓度依赖性反应。
14
芽孢杆菌通讯员的选择
萤火虫萤光素酶是迄今为止最常用的生物发光通讯员。天然萤火虫荧光素酶作为遗传报告基因的普及 是由于酶测定的灵敏度和方便性以及蛋白质合成与酶活性的紧密耦合。由luc基因编码的萤火虫荧光 素酶是不需要任何翻译后修饰的单体; 它可以作为成熟酶直接在其mRNA翻译中获得。从核糖体释放 后立即获得催化能力。此外，荧光素酶在细胞中的半衰期非常短（约3小时）。综合起来，这些性质 使荧光素酶成为一个非常敏感的通讯员，远远超过其他常用的通讯员。
力结合。例如可用于结合含有His标签的蛋白质的Ni-NTA树脂（或珠
粒）。如果蛋白质以这种方式结合到珠粒上，则其特征然后确定这种 负载蛋白质的珠粒的功能特性。 这样的珠通常是相当昂贵的，蛋白质 与珠子的偶联是费力的，因为蛋白质必须被表达，结合到珠子上然后
洗涤。为了解决这个问题，我们已经开发出在我们的项目中的合成生
质CotZ和CgeA组成。这就是为什么我们用它们来创建我们要表达功能融合
蛋白孢粉珠。
19
保证孢粉珠的安全
基因敲除
我们选择了重要的发芽基因并将其敲除。随后，我们将单个突变体组合成四倍体突变体， 并成功地防止了萌发。
自杀开关
在发芽基因敲除失败的情况下，我们发明了自杀开关。如果孢子仍然发芽，毒素的产生将 导致立即的细胞死亡。
菌有天然的外源基因摄入和整合入基因组的机制，这种机制为遗传操作提供了方便；革兰氏 阳性菌的分泌机制比较完善，蛋白质表达后可以很好地分泌到细胞外，而这正是革兰氏阴性
菌在异源蛋白表达时面临的最大问题。
7
枯草芽孢杆菌的转化
枯草芽孢杆菌可以复制大肠杆菌的质粒，但是有一种更优雅的方
式引入外源DNA片段。当侧面与枯草芽孢杆菌基因组同源时，将 通过在该基因座处的同源重组以高效率整合，随后用染色体复制。 这导致稳定的单拷贝基因组改变，从而避免使用复制质粒发生的 拷贝数伪影。这种不同的基因操作的方式需要使用整合载体，如 通过我们提供B4-22。因此，枯草芽孢杆菌是合成生物学的理想 遗传平台。
们取名枯草芽孢杆菌。革兰氏阳性
菌，菌落表面粗糙不透明，污白色
或微黄色，在液体培养基中生长时，
常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白
质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形
成吲哚。
3
枯草芽孢杆菌的生命周期和不同的细胞阶段。
枯草芽孢杆菌能够分化成具有不同形态和功能的细胞。最特征的形式是在营养不足的情况下产生 的内生孢子。在我们的项目中，我们利用了内生孢子的生产。因为它们是极其稳定的，孢子是用 于功能性融合蛋白的。