抗生素的作用机制

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利福平在完整细胞水平上的作用机制
原初效应
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二、在部分纯化的无细胞体系中对活性的研究
一旦确定了抗生素的原初效应，接着就必 须阐明产生抑制是因为抗生素干扰： (1) 前体物的合成或激活； (2) 参与聚合的酶或细胞器； (3) 决定前体物掺入聚合物的信息系统。
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细胞外实验：部分纯化的细胞抽提物
具体操作过程
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肽聚糖链合成的示意图五肽
P-P-Lipid HO-G-M-P-P- Lipid 转糖基反应
五肽
细胞壁
通过转肽反应及转糖基反应，双糖五肽被转到受 体上，即新生肽聚糖链。在转糖基反应中，十一 聚异戊二烯焦磷酸释放出来，重新进入循环。
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大肠杆菌肽聚糖的结构
转糖基酶, 转糖基反应
转肽酶, 转肽反应
3
抗生素的作用机制
抗生素在分子水平上干扰微生物细胞任一基本代谢的某一种机制。 影响胞浆膜 的通透性 抑制细胞壁的 合成
抑 制 成 合 DNA
抑制蛋白质合成
影响叶酸代谢
抑制RNA合成
根据抗生素干扰代谢过程的不同，抗生素 通常分为五大类
(1)细胞壁合成抑制物； (2)遗传物质的复制或转 录抑制物； (3)蛋白质合成抑制物； (4)细胞膜功能抑制物； (5)抗代谢物。
十一聚异戊二烯磷酸
N－乙酰葡萄糖胺转移酶
×
十一聚异戊二烯－胞壁酰－五肽
十一聚异戊二烯焦磷酸
它能够快速而特异地抑制生长细胞对N－乙酰葡萄糖胺的吸收， 导致细胞内UDP－胞壁酰五肽的积累，而抑制细胞壁合成。
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３. 链延伸及三维细胞壁结构形成抑制物
β－内酰胺类抗生素：这个家族抗生素包括青 霉素、头孢菌素、头霉素和非经典的β－内酰 胺类抗生素，如氨曲南和亚胺培南。 这些抗生素的作用机制相似，即阻断肽聚糖合 成的最后一个阶段以干扰细胞壁形成。
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大肠杆菌和金黄色葡萄球菌肽聚糖的结构
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二、细菌细胞壁合成抑制物的特性
杀菌作用：可以通过两种机制产生杀菌效应， 裂解或不裂解细胞。在第一种情况下，肽聚糖 结构变得松弛，导致细胞由于内部高渗透压而 解聚死亡；在第二种情况下，可能有其他作用 机制的介入，譬如不可逆地抑制横隔形成 （PBP-3）或细胞变长(PBP-3)，从而导致细 胞死亡。 对静止细胞无作用。 对缺乏细胞壁的微生物（支原体、 L型细菌、 原生质体）没有作用。
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单体在上合成的示意图
UDP－Glc
β，1－4糖苷键 十一聚异戊二烯磷酸
UDP－胞壁酰五肽
细胞膜
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(3) 肽聚糖链的组装及三维结构的构建
肽聚糖合成的最后几步是由几种酶催化完成。 ①转糖基酶：催化M上的C－1与G上的C－4之间形成β －糖苷键。②转肽酶：催化4－位上的D－Ala与邻近五 肽上DAP的ε－氮形成肽键(该反应通过释放五肽供体上 的末端D－Ala而发生)。③D－羧肽酶：催化五肽末端D －Ala水解。④内肽酶：催化水解已合成的肽聚糖链上 的肽链。 微生物在生长及分裂期间，必然要合成新的肽聚糖， 这时内肽酶在细胞壁内表面变得活跃起来，部分地水 解已存在的链，产生出自由末端，通过转肽及转糖基 反应，接受新生的肽聚糖链。
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利福平在纯化的酶体系中的作用机制
β亚基突变
×
β 利福平
RNA
×
×
β亚基＋利福平的复合物
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第三节 细胞壁合成抑制物
首先简要介绍不同种类微生物的细胞壁化学结 构和主要成分的合成途径。
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一、细胞壁的结构和构造
细胞壁的功能 保持细菌外形 维持菌体内高渗透压
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肽聚糖的结构
N—乙酰葡萄糖胺(G) N—乙酰胞壁酸(M)
RNA聚合酶 核苷三磷酸
DNA为模板
×
RNA
利福平
这个体外转录体系由细菌的RNA聚合酶催化时，其活性 将被利福平抑制，由真核细胞的RNA聚合酶催化时，其 活性并不被利福平抑制。 推论：生长细胞中RNA合成的阻断，来自于利福平与 RNA聚合酶的直接作用。
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三、在纯化的酶体系中对活性的研究
聚合酶通常包含多种成分，每一种成分都可能 成为抗生素作用的靶子。 在一定限度内，能够确定是哪一种酶反应受到 了干扰，并且鉴定出哪一个成分是抗生素作用 的靶子。
55
真核细胞中RNA聚合酶
48
R-C-NH-CH-CH2 =
=
O
C—N O D-丙氨酰-D-丙氨酸
CH3 CH-COOH
=
O S C R-C-NH-CH-CH C—N
胞壁酸
CH3 CH3
CH-COOH
青霉素
青霉素结合蛋白 （PBPs，转肽酶）
第四节 核酸复制与转录抑制物
DNA复制 RNA转录
50
一、遗传信息的转录与复制
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第二节
研究方法
为了阐明一个抗生素的作用机制，需要进行一 系列的实验研究。 包括：(1) 完整细胞水平，(2) 部分纯化的无细 胞体系水平，(3) 一个或多个纯化的酶体系水 平。
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一、在完整细胞水平上对活性的研究
DNA
放射性标记 特异前体物
敏感菌株的培养基
RNA
蛋白质
肽聚糖
抗生素
用标记的胸苷追踪DNA合成、尿苷追踪RNA合成。苯 丙氨酸追踪蛋白质合成。乙酰葡萄糖胺追踪肽聚糖合成。
第三章 抗生素的作用机制
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第一节 一般性论述
抗生素是微生物群 体生长的抑制物。 群体生长来自单个 细胞繁殖，即构成 细胞物质的复制和 随后细胞分裂为两 个子细胞过程。
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抗生素影响微生物细胞的代谢的条件
(1) 进入细胞并到达作用位点； (2) 物理性地结合于细胞结构(靶分子)，该细 胞结构参与对保持细胞生长或内环境稳定必不 可少的某一过程； (3) 抗生素与主要酶或细胞结构结合。
1.聚合的酶或细胞器 前体物 2.信息系统
合成或激活
DNA
RNA
蛋白质
肽聚糖
抗生素
如果抗生素在体外抑制与在生长细胞中所抑制的大分子相 同，那么它通常作用在聚合过程，也可能作用于信息分子； 如果体外不抑制，而生长细胞中抑制，则可能作用于前体 物的合成或激活。 10
利福平在部分纯化的无细胞体系中作用机制
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环丝氨酸的作用机制
环丝氨酸
× ×
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丙氨酸消旋酶
D－丙氨烯－D－丙 氨酸二肽合成酶
2．膜上反应抑制物
一个是杆菌肽，使用在畜牧业上；另一 个是雷莫拉宁。
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杆菌肽的的作用机制
UDP－胞壁酰五肽
十一聚异戊二烯磷酸
×
十一聚异戊二烯焦磷酸
杆菌肽
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雷莫拉宁的作用机制
雷莫拉宁
UDP－Glc
UDP－胞壁酰五肽
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靶聚合体系的鉴定
（1）通过放射化学方法或检测蛋白质色谱变 化或蛋白质电泳迁移率变化，鉴定出抗生素与 酶蛋白结合后形成的复合物。
（2）从抗生素抗性突变株中可以分离出抗生 素作用的靶蛋白发生了变化而产生的抗性菌株。 在体外每次分别将原株中靶蛋白的一种成分用 抗性变株来代替构成重组系统，根据抑制的消 失可以确定靶蛋白中与抗生素活性有关的组份。
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1．G＋细菌的细胞壁
G＋细菌的细胞壁是一层均一物质，由肽聚糖和相 当数量的磷壁酸组成。
膜磷壁酸 壁磷壁酸
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2．G－－细菌的细胞壁
亲水性的跨外膜孔蛋白
1外膜
2 脂蛋白
3 肽聚糖
壁膜间隙
质膜
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G＋` G－细胞壁成分的区别
占细胞壁干重的% 成 分 G＋ 肽聚糖 磷壁酸 类脂质 蛋白质 G－
含量很高（30-95） 含量很低（5-20） 含量较高（<50） 0 一般无（<2） 0 含量较高（10-20） 含量较高
G
UDP-N-乙酰葡萄糖胺
M
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(1) 基本单元UDP-胞壁酰五肽的形成
N－乙酰葡萄糖胺（G）以其激活形式UDP－G 与磷酸烯醇式丙酸酮缩合，双键还原形成UDPN－乙酰胞壁酸（UDP－M）； L－Ala、D－Glu和间－DAP相继加到UDP－M 上，生成中间物胞壁酰三肽，二肽D－Ala－D －Ala(由两个L－Ala分子异构和缩合而来)又加 到胞壁酰二肽上，形成UDP－胞壁酰五肽终产 物。 所有这些反应均发生在细胞质中。
-内酰胺类作用机制
G M G G M G
转肽酶 D-丙氨酸
G M G
青霉素 头孢菌素
G
M
G
青霉素和D－Ala－D－Ala二肽的结构构象
O O O N O O N O
R
N R O N
胞壁酰五肽D-Ala-D-Ala末端构象
O
青霉素构象
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青霉素结合蛋白(PBP)
被β－内酰胺类抗生素抑制的酶，因它们能够与相应 的抗生素形成共价键而得到鉴别，它们称为青霉素 结合蛋白(PBP)。 细胞生长必需的PBPs一般具有转肽酶活力，它们控 制着细胞延长（PBP-1）及分裂(PBP-3)这些基本过 程。 β－内酰胺类抗生素在抑制参与肽聚糖合成的酶上， 还是有一定程度的不同：有的抑制转肽酶，有的抑 制d－羧肽酶，有的间接抑制转糖基作用的酶。
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链 球 菌
G+菌----紫色
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大 肠 杆 菌
G-菌----淡红色
22
铜绿假单胞菌
G-菌----淡红色
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3．肽聚糖的生物合成
大肠杆菌肽聚糖的生物合成可以分为三个阶段。 (1) 基本单元UDP-胞壁酰五肽的形成 (2) 单体的形成及跨膜转运 (3) 肽聚糖链的组装及三维结构的构建
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UDP－胞壁酰五肽的结构
核酸合成分两步： (1) 从细胞代谢中间物分子合成前体物(核苷酸 和脱氧核苷酸) (2) 酶催化核苷酸聚合形成大分子，其顺序由 模板DNA碱基顺序决定。 若干种不同的酶参与了DNA复制。
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DNA复制
单链DNA结合蛋白 DNA解旋酶
大肠杆菌中的Dna蛋白
DNA在复制时，其双 链首先解开，形成复制 叉，而复制叉的形成则 是由多种蛋白质及酶参 与的较复杂的复制过程。 前导链与后随链的 差别在于前者从复制起 始点开始按5’—3’持续的 合成下去，不形成冈崎 片段，后者则随着复制 叉的出现，不断合成长 约2—3kb的冈崎片段。
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RNA链
原核细胞中RNA合成
RNA合成过程相对简单。在细菌中是由RNA聚 合酶催化的。 RNA聚合酶由四个蛋白质亚基α 、α 、β 、β ’ 及一个σ 因子(对识别转录起始DNA顺序必需) 组成。
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RNA聚合酶的功能
(1)通过与DNA形成复合体将DNA双链分开。 (2)将第一个核苷酸放在其中一条DNA链上的正 确位置上(起始)。 (3)将第二个核苷酸掺入并在第一和第二个核苷 酸之间形成第一个磷酸二酯键。 (4)沿DNA链移动，并继续将核苷酸不断掺入， 并以磷酸二酯键将它们连接起来(延伸)。 (5)当到达一段特殊的DNA顺序时，合成过程终 止(终止)。在许多情况下，终止需要另一个蛋 白质因子rho(ρ )参与。
滞后链
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前导链
大肠杆菌DNA复制示意模型
(1) DNA解旋酶解开双螺 旋。一些蛋白保持双链分 开。 (2)在前导链上由引物酶 催化合成一段RNA引物。 (3)DNA 聚 合 酶 III 利 用 RNA为引物，在3’－OH上 合成冈崎片段。 (4 ， 5)DNA 聚 合 酶 I 降 解 RNA片段并完成DNA合成。 (6)连接酶将相邻片段连 接上。
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青霉素G对放射性同位素标记前体物掺入生长细 菌中DNA、RNA、蛋白质及细胞壁的效应
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β—内酰胺类抗生素的作用机制
1. 抑制细菌细胞壁的合成
β—内酰胺 类抗生素抑 制细菌细胞 壁粘肽转肽 酶（青霉素 结合蛋白 PBPs）
粘肽合成受 阻
细菌细胞壁 缺损
水分渗入胞 浆
菌体膨胀破 裂而死亡。
2. 触发细菌的自溶酶活性
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UDP－胞壁酰五肽形成示意图
胞浆
UDP-N-乙酰胞壁酸
胞壁酰三肽
磷酸烯醇式丙酸酮
UDP-N-乙酰葡萄糖胺
UDP－胞壁酰五肽
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(2) 单体的形成及跨膜转运
UDP－胞壁酰五肽首先脱去UMP，胞壁酸的端 基异构体C原子与十一聚异戊二烯磷酸(类脂分 子，作为胞壁酰五肽的载体)形成二磷酸二酯 键。通过β，1－4糖苷键，N－乙酰葡萄糖胺加 到胞壁酸上，从而完成了单体的合成。 这些反应发生在细胞质膜上。
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三、肽聚糖合成抑制物的例子
根据作用部位，肽聚糖合成抑制物可分为：
1. 胞壁酰五肽合成抑制剂 2. 膜上反应抑制物 3. 链延伸及三维细胞壁结构形成抑制物
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1．胞壁酰五肽合成抑制剂
这些抗生素都是肽聚糖合成前期反应的 抑制物。
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磷霉素的作用机制
磷霉素
烯醇式丙酮酰－N－G
×
丙酮酰转移酶
不可逆，杀菌作用
内肽酶
D－羧肽酶
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细菌的肽聚糖合成
所有细菌种类的肽聚糖合成，都是按照大肠杆 菌模式进行的。 但是，在金黄色葡萄球菌中，发生了重要变化： ①五肽中第二位氨基酸是Lys，而不是m－DAP。 ②二糖五肽合成后，五个Gly分子通过肽键连 接在Lys的ε－NH2上。③转肽反应在五肽次末 端D－Ala的羧基(同时释放出末端D－Ala)和末 端Gly的氨基之间发生。