蛋白质的提取与分离分离

膜蛋白的提取与分离
➢ 膜蛋白指多肽链跨越脂双层数次的蛋白， 被定义为膜整合蛋白或膜内在蛋白。
➢ 膜内在蛋白的跨膜结构域必须折叠形成α螺 旋或β片层的二级结构，
➢ 膜蛋白处于细胞边界，在细胞的各种生命 活动中发挥重要作用。
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膜蛋白提取中有两点需要注意
（1）膜蛋白的纯度如何？ （2）膜蛋白很难出现在二维凝胶图谱中
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➢ 细胞在水相、去污剂中进行裂解时，细胞膜和内膜 网络将会断裂成碎片或颗粒，通过沉淀或分级技术 加以分离。但这些技术也能分离膜连的细胞器 。
➢ 蛋白浓度高的样品，如血清、血浆，可用 适当样品溶解液稀释后直接分析；
➢ 含有较低蛋白质浓度或较高盐浓度的样品， 可通过透析或液相色谱脱盐，通过冻干、 对聚乙二醇的透析或TCA/丙酮沉淀的方法 进行浓缩。
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组织样品制备
➢ 固体组织样品常在裂解液中破碎，最好的 方法是将组织在液氮中冷冻破碎。
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蛋白酶抑制剂
细胞裂解时，蛋白酶释放出来，会影响二维 电泳的结果，因此需采取措施抑制蛋白酶 的活性。
常用策略：
（1）直接加入强变性剂
（2）低温、碱性条件下进行样品制备 （3）使用蛋白酶抑制剂（PMSF 、Protease
inhibitor cocktail)
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蛋白沉淀方法
➢ 对于固体基质中培养的细胞，应先除去培 养基质，用PBS或等渗蔗糖溶液清洗细胞 层，然后再通过刮擦法收获细胞；或者加 入体积裂解缓冲液，直接将基质上的细胞 裂解。
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样品预分级
（1）蛋白质溶解性进行分级 （2）蛋白质在细胞中不同的细胞器定位进行
分级，如专门分离出细胞核、线粒体或 高尔基体等细胞器的蛋白质成分（亚细 胞分级）。 ➢ 样品预分级不仅可以提高低丰度蛋白质的 上样量和检测，还可以针对某一细胞器的 蛋白质组进行研究。
第三章 蛋白质的提取与分离
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3.1 蛋白质样品制备
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➢ 目前，二维聚丙烯酰胺凝胶电泳依然 是大多数蛋白质组研究中复杂蛋白混 合物的核心技术。而选择合适的样品 制备方法对获得满意的二维电泳图谱 是十分重要的。
➢ 对不同类型的蛋白进行样品制备时，
需要采用不同的方法和条件。溶解的
细胞壁的细胞
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剧烈的蛋白裂解方法
常用于难于破碎的细胞，如固体组织内的细胞， 或具有坚硬细胞壁的细胞，如酵母细胞。 常用方法： （1）超声波裂解法：细胞样品 （2）弗氏压碎器：高压下迫使细胞穿过小孔径
而产生剪切力，从而裂解细胞；常用于 含有细胞壁的微生物、藻类 （3）研磨法：常用于固体组织、微生物；冻存于 液氮中，随后研磨成粉末 （4）机械匀浆法： （5）玻璃珠匀浆法：利用剧烈振荡的玻璃珠打破 细胞壁；用于细胞悬液或微生物
效果依靠选择的细胞破碎方法、蛋白
解聚和溶解方法、去污剂和裂解液成
分等来实现。
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样品制备的原则
1.尽可能采用简单方法，以避免蛋白丢失； 2.细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白质的降
解，低温和蛋白酶抑制剂可防止蛋白质的降解； 3.样品裂解液应新鲜制备，并分装存于-80℃。勿反
复冻融已制备好的样品； 4.通过超速离心清除所有的杂质； 5.加入尿素之后加温不要超过37℃，防止氨甲酰化
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亚细胞器分离与蛋白质提取
➢ 亚细胞器的纯化和分级可获得高度纯化和富集的 蛋白
➢ 依据密度差异进行细胞分级
➢ 一般方法：低速离心分离出细胞核和未破碎细胞， 得到上清夜。然后梯度离心分离各种细胞器。
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Detergent Fractionation
Cells
Extraction with Digitonin/EDTA
而修饰蛋白。
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温和的裂解方法
用于组成比较简单的样品，或分析某一特定 的细胞器。
常用方法：
（1）渗透裂解：血细胞、组织培养细胞
（2）冻融裂解：细菌、组织培养细胞；液氮 冻融
（3）去污剂裂解：用去污剂溶解细胞膜、裂 解细胞，释放内容物；用于组织细胞
（4）酶裂解细胞：植物、细菌和真菌等含有
Cytoskeletal (in SDS)
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Subcellular Fractionation
Human mitochondrial proteins
Human nuclear proteins
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实例
1. 膜蛋白 2. 核ຫໍສະໝຸດ Baidu白
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➢ 组织样品存在样品异质性问题，通常采用 基于免疫亲和技术的正、负性选择，以富 集特殊的细胞群，裂解后可直接应用。
➢ 目前，微量切割技术可以用来从组织样品 中获取纯的细胞群，其中最受关注的是激 光捕获微量切割技术（LCM）。
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细胞样品制备
➢ 细胞样品理想的方法是通过离心收集，随 后用磷酸盐缓冲液清洗并溶于样品缓冲液。
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样品制备的分类
➢ 可溶性样品制备 如血清、血浆、尿样、脑脊液以及细
胞和组织的水溶性提取物。 ➢ 组织样品制备 ➢ 细胞样品制备
体外悬浮培养生长的细胞或周期性细 胞样品（如红细胞、淋巴细胞） ➢ 样品分级 真核生物组织蛋白质
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可溶性样品制备
➢ 经过很少的前处理便可进行2-DE分析。
supernatent
pellet
Cytoplasmic Fraction
Extraction with TritonX100/EDTA
supernatent
pellet
Organelle Membranes
Extraction with SDS/EDTA
supernatent
pellet
Nuclear
➢ 硫酸铵沉淀（盐析） ➢ TCA沉淀（三氯醋酸沉淀） ➢ 丙酮沉淀 ➢ 在丙酮中加TCA沉淀 ➢ 用苯酚提取，随后在甲醇中用醋酸铵沉淀
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影响二维电泳图谱的杂质
1. 盐离子、痕量缓冲液和其它带电荷的小分子-透析 2. 内源小分子（如核苷酸、代谢物和磷酸）-TCA/丙酮 3. 离子去污剂-丙酮or低温沉淀 4. 核酸（RNA、DNA）-DNase/RNase 5. 多糖-硫酸铵or苯酚/醋酸胺 6. 脂类-去污剂 7. 酚类组分-PVP 8. 不溶物质-离心