高效液相色谱分析

第一节 吸附色谱法
黏度η 是影响色谱分离的重要参数，黏度大，会影响 组分在流动相中的扩散系数及在两相间的传质速度，并降
低色谱柱的渗透性，导致柱效下降和分析时间延长。
流动相黏度应保持在0.4～0.5mPa· s。对于黏度0.2～0.3 mPa· s的溶剂，可与黏度大的溶剂混合使用；对于黏度小于 0.2mPa· s的溶剂，沸点太低，高压泵输液过程中容易产生气 泡，不易单独或高混合比例使用。
色谱分析法是分析化学中获得广泛应用的一个重要分支，从 20世纪初俄国植物学家茨维特( M.S．Tswett)提出经典液相色谱法 后，色谱分析法取得迅速发展。 包括柱色谱、薄层色谱和纸色谱的经典色谱操作繁琐，分析 时间冗长，未受到重视，期间主要发展气相色谱。 20世纪60年代末随色谱理论的发展，色谱工作者已认识到采 用微粒固定相是提高柱效的重要途径，随着微粒固定相以及高压 输液泵和高灵敏度检测器的研制成功，液相色谱法获得了新生。
第二节 高效液相色谱仪器
5. 检测器 A. 紫外检测器（UVD） 应用最广，对大部分有机化合物有响应。 灵敏度高；线形范围宽；死体积小(1mm×10mm，容 积 8μL)；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选， 易于操作；可用于梯度洗脱。
第二节 高效液相色谱仪器
B. 光电二极管阵列检测器（PDAD） 由1024个光电二极管排成阵列，分别同时(10ms)检测 180～600nm波长的光，计算机处理并绘制不同时间与不同 波长的数据，获得A-λ-t信息的三维立体谱图，如图所示。
球形
球形 球形 球形 球形
37～55
5～10 6～8 5，10，20 5～15
400～300
370 300～250 500～300 380～250
30
10 6～8 8～10 8～50
青岛海洋化工厂
E．Merck（德） Du Pont(美) Separation Group(美) 东洋曹达（日）
Nucleosil
组分在气相中的扩散系数大， 组分在液相中的扩散系数很小，105cm2/s； 10-1cm2/s； 柱温影响很大(室温～300)； 柱温影响很小(室温～60)； 柱外效应及死体积影响较小 柱外效应及死体积影响很大 通用型：TCD、FID 专用型：ECD、FPD、NPD 最高灵敏度：10-11g 永久性气体； 通用型：ELSD、RID 专用型：UVD、PDAD、FD、ECD 最高灵敏度： 10-12g 离子型化合物； 低分子量、低沸点化合物(分子量： 50～3×103) ； 高分子、生命活性化合物(分子量： 103～106)； 难用于制备
惰性气体 动力粘度10-5Pa· s 柱前压力2～30MPa 种类较多 粒度0.1～0.5mm 填充柱1～4×1～3 毛细管柱 0.25～ 0.5×10～100
有适当的溶剂溶解
极性、非极性液体及缓冲溶液 动力粘度10-3Pa· s 柱前压力0.1～0.5MPa 种类较少 粒度3～10µ m 填充柱0.5～ 6×0.1～0.3 毛细管填充柱 0.03～ 0.05×0.15～0.5
第二节 高效液相色谱仪器
第二节 高效液相色谱仪器
第二节 高效液相色谱仪器
C. 示差折光检测器（RID） 通过检测参比池和样品池中液体(参比液和流动相)之间 的折光指数差值，表示流动相中溶质的浓度。 通用型检测器；灵敏度低；对温度敏感；不能用于梯 度洗脱。
第二节 高效液相色谱仪器
偏转型示差折光检测器光路结构
第一节 高效液相色谱法的特点
四、高效液相色谱法的局限 a 溶剂用量太大； b 缺乏诸如气相色谱使用的TCD、FID通用型检测器； c 不能替代气相色谱法，难分离化合物(柱效10万以上)， 必须使用毛细管气相色谱法进行分离。 d 不能替代中、低压柱色谱法，一些生物活性化合物不能 承受200kPa～1MPa压力。
第二节 高效液相色谱仪器
F. 电导检测器（ECD）
第二节 高效液相色谱仪器
第二节 高效液相色谱仪器
第二节 高效液相色谱仪器
第二章 高效液相色谱主要类型分离机制
第一节 吸附色谱法 第二节 分配色谱法
第三节 离子交换色谱法
第四节 凝胶(体积)排阻色谱法
第一节 吸附色谱法
基本原理：固定相对组分的吸附或解吸作用差别，使组分 分离。吸附等温线为非线性，且与解吸等温线不重合。使
型、位置、数量有差异时，产生分离效应。
特别指出的是，近年来发展的石墨化炭黑(粒度5～7µ m、孔 径25nm、比表面积110m2/g、耐压70MPa)，对非极性化合物具
有强烈的保留，对官能团不同的极性化合物呈现亲和倾向差异。
如高极性化合物、几何异构体、非对映异构体分离，流动相中 加手性添加剂，可用于手性化合物分离。
第二节 高效液相色谱仪器
2. 梯度淋洗装置 外梯度：利用两台 高压输液泵，将两种不 同极性的溶剂按一定的 比例送入梯度混合室， 混合后进入色谱柱。 内梯度：一台高压 泵, 通过比例调节阀,将 两种或多种不同极性的 溶剂按一定的比例抽入 高压泵中混合。
第二节 高效液相色谱仪器
3. 进样装置 流路中为高压力工作状态， 通常使用耐高压的六通阀 进样装置。 六通阀结构如图所示：
Supeleosil YWG-1 µ-Porasil Lichrosorb Si-60,100 Polygosil YDG Spherisoed AY
球形
球形 无定形 无定形 无定形 无定形 堆积 球形 无定形 无定形 球形 球形
球形 球形
5～10，15～63
3，5 5，7 ,10 10 5，10 5，7，10 3，5，10 5，10，30 5，10，30 5，10 15 15
作为色谱的一个分支，高效液相色谱(high performance liquid
chromatography，HPLC)法在经典液相色谱法和气相色谱法的基础 上，发展起来的新型分离分析技术。
第一节 高效液相色谱法的特点
一、与经典液相色谱法比较
经典液相色谱法 高效液相色谱法
色谱柱长/mm
柱内径/mm 填料粒径/µ m 柱前压力/MPa 柱效(理论塔板数)/m 进样量/g 分析时间/h
氧化铝
Lichrosorb ALOX-T Micro Pak-AL 40
苯乙烯-乙 烯基共聚 物聚合度
60
80 97
第一节 吸附色谱法
c. 固定相与组分作用机制：固定相表面的羟基、桥联的羟基、 氧桥、金属元素或离子与组分极性基团、不饱和键、螯合化合 物，甚至低pH值是发生的离子交换。 同时，流动相分子对吸附活性中心通过竞争性吸附，使组 分与固定相不断发生吸附-解吸。当组分分子结构以及官能团类
第二节 高效液相色谱仪器
4. 色谱柱 柱体为直型不锈钢管，常规柱内径2～6 mm，柱长10～ 30cm；微孔填充柱内径0.5～1.0mm，柱长10～15cm；填充 毛细管柱内径30～50µ m，柱长15～50cm。 常用色谱柱填料粒径为5µ m，近年出现3µ m快速柱，小 柱径、小颗粒、高柱效是色谱柱的发展趋势。
第一节 吸附色谱法
溶解度参数δ 是溶剂与溶质分子间作用力的总量度， 它是分子间4种作用力的总和，δ = δ
d
+ δ
o
+ δ
a
+ δ h。
溶解度参数δ 愈大，与固定相的亲和能力愈强，洗脱
能力愈强，使组分在固定相上的容量因子k '愈小。在选择 溶剂的δ 使组分的1≤k ' ≤10时，改变不同的溶剂，使δ
15 15
450～200
170～75 300 400 500～400 450～35 300 100 70 70 269 463
644 674
5，10，30，400
10～30 6～8 ≈10 6～10 60，10，30，50 10 15 15 200～500 30～50
10～30 10～30
Macherey-Nagel(德)
色谱峰常常出现拖尾。组分子官能团性质、位置、多少影
响固定相选择性。 1. 液固吸附色谱
a. 固定相种类：常用极性有硅胶、硅酸镁、氧化铝等，
非极性有多孔活性炭、石墨化炭黑、高交联度苯乙烯-二乙 烯基苯共聚物等。结构有全多孔和薄壳型。 b. 固定相性质参数：粒度、形状、比表面积、孔容、孔 度、平均孔径等。
100～2000
10～50 75～600 0.001～0.1 2～50 1～10 1～20
100～250
3 ～6 3～10 2～20 2×103～5×104 10-6～10-2 0.05～1.0
第一节 高效液相色谱法的特点
二、与气相色谱法比较
气相色谱法 高效液相色谱法
对样品要求
流动相
ຫໍສະໝຸດ Baidu
容易气化或裂解
应用范围
～350℃低沸点化合物(分 子量：1～102)； 易裂解的高分子化合物 (分子量：102～103)； 可用于制备。
第一节 高效液相色谱法的特点
三、高效液相色谱法的发展 1.固定相的变化 填料粒度减小，粒型规整；键合型固定相；整体结构 固定相；亲和固定相。目前，出现使用1.0µ m填料的超高压 液相色谱。 2.流动相变化 目前，出现120～220℃超热水为流动相、FID和FPD检 测器的HPLC。 3.全新方法 剪切流路液相色谱；不同分离机制组合的多维液相色 谱以及HPLC与MS、NMR、IR联用的多维液相色谱法。
高效液相色谱分析
第一章 概述
第一节 高效液相色谱法特点 第二节 高效液相色谱仪器
第二章 高效液相色谱主要类型分离机制
第一节 液固吸附色谱法 第二节 液液分配色谱法 第三节 离子交换色谱法 第四节 凝胶排阻色谱法
第三章 高效液相色谱应用
第一节 HPLC方法选择 第二节 分离条件优化
第三节 液质联用
第一章 高效液相色谱分析概述
第一节 吸附色谱法
d. 流动相：可作为流动相的溶剂，除沸点、紫外吸收满 足要求外，对改善分离起重要作用的特性参数有溶剂强度
ε°、溶解度δ ，极性参数P'和黏度η。
溶剂强度参数ε°愈大，与固定相的亲和能力愈强，洗 脱能力愈强，使组分在固定相上的容量因子k '愈小。二元混
合溶剂可按各自的溶剂强度、混合摩尔比、吸附剂活性计算 。
第一节 吸附色谱法
常用硅胶吸附剂物理性质
类型 YQG 商品名称 形状 球形 粒度(µm) 5～10 比表面积(m2/g) 300 平均孔径(nm) 30 生产厂商 北京化学试剂研究所
YQG-1
Lichrospher Si-100 Zorbax SIL Vydac HS TSK gel LS-310 全多孔 硅胶
Supelco(美) 青岛海洋化工厂 Waters(美) E．Merck(德) Macherey-Nagel(德) 上海试剂一厂 Chrompak(荷兰) E．Merck(美) Varian(美) Phamacia(瑞):SOURCE Waters(美):U-Styragel Yanaco(日):Gel-5510
第二节 高效液相色谱仪器
一、高效液相色谱法流程
第二节 高效液相色谱仪器
二、主要部件 1. 高压泵 输液压力： 150～350×105 Pa。 为了获得高柱效而使用粒 度很小的固定相(<10μm)，液 体的流动相高速通过时，将产 生很高的压力，因此高压、高 速是高效液相色谱的特点之一。 应具有压力平稳、脉冲小、 流量稳定可调、耐腐蚀等特性。
固定相 色谱柱(内径 φ×L)/mm×m 柱效(理论塔板数)/m 柱温/ ℃ 分离过程中的作用
103～104
室温～300 固定相←→组分
104～105
室温～60 固定相←→组分←→流动相
第一节 高效液相色谱法的特点
气相色谱法 分离机制 影响分离 的重要因 素 检测器 吸附、分配 高效液相色谱法 吸附、分配、离子交换、凝胶排阻
第二节 高效液相色谱仪器
反射型示差折光检测器的光路结构
第二节 高效液相色谱仪器
干涉型示差折光检测器光路结构
第二节 高效液相色谱仪器
D. 荧光检测器（FD） 高灵敏度，高选择性。 对多环芳烃，维生素、 真菌毒素素、卟啉类化合 物、大分子药物、氨基酸 与蛋白质等有响应。
第二节 高效液相色谱仪器
E. 蒸发光散射检测器（ELSD）
d
、
δ
o
、δ
a
、δ h不同，可以提高色谱系统的选择性。
第一节 吸附色谱法
极性参数P'是每种溶剂与乙醇(e)、二氧六环(d)和硝 基甲烷(n)相互作用，表示接受质子、给出质子和偶极相互 作用能力的量度， P' =lg(K")e+ lg(K")d+ lg(K")n。 极性参数P'愈大，与固定相的亲和能力愈强，使组分在 固定相上的容量因子k '愈小。在选择溶剂的P’ 使组分的 1≤k'≤10时，改变不同的溶剂，使K"e、 K"d、K"n不 同，可以提高色谱系统的选择性。