脱细胞真皮基质分析实施报告

前言

大面积深度烧伤或其他创伤导致皮肤真皮成分缺损，通过刃厚小皮片或微粒植皮技术虽然能使创面愈合，但由于其缺乏真皮层，导致愈合后创面弹性差，凸凹不平，易挛缩且不耐摩擦。移植自体皮瓣或全厚及中厚皮片固然是最好的方法，但大面积深度烧伤后，能作为供皮区的部位已很少，供皮区又将形成同等程度的缺损，日后形成瘢痕。为解决这一问题，国内外学者致力于寻找一种理想的真皮替代品。

1.脱细胞真皮基质概述

脱细胞真皮基质（acellular dermal matrix ADM）是用物理、化学等方法将人或动物皮肤中的表皮层及细胞成分彻底去除仅保留真皮中含胶原网架的细胞外基质。

脱细胞真皮基质由于完全没有了细胞成分和Ⅰ、Ⅱ型细胞相容性抗原的主要免疫活性,故一般不会诱发排斥反应。但脱细胞真皮基质保留有正常胶原的三维结构和真皮中含胶原支架的细胞外基质能为组织细胞的再生提供一个良好的支架结构，具有创面覆盖、组织缺损填充、引导组织再生和支架等作用。

脱细胞真皮基质中无细胞成分,免疫活性低,不会诱发免疫反应。它保留了表皮和真皮间的基底膜,移植后可形成真皮面和基底膜面。基底膜面可支持断层皮片的生长,这对表皮细胞的增殖分化以及移植皮的外观和功能起着重要作用,同时也有利于种子细胞的點附增殖等。真皮面利于脱细胞真皮基质的快速血管化,为成纤维细胞的增殖提供支架,有助于胶原成分改建,促使成纤维细胞排列分布规则,形成结构形态正常的胶原纤维,此外,还有诱导、调节宿主细胞和新生血管长入,促进上皮形成等作用。此外,细胞外基质蛋白也可以促进表皮细胞的再生。因此,

脱细胞真皮基质可作为真皮替代品,在为烧伤创面提供真皮的同时,可明显减少瘢痕形成。是一种理想的真皮替代材料。

1.1脱细胞真皮基质的制备方法

根据来源的不同脱细胞真皮基质分为异体脱细胞真皮基质（来源主要为尸体皮）和异种脱细胞真皮基质（来源为动物皮以猪皮和牛皮为主）两种。制备过程都是尽可能的去除具有抗原性的细胞(表皮细胞、毛囊、皮脂腺、汗腺及真皮中血管内皮细胞、成纤维细胞等), 保留完整的胶原纤维成分和组织基本结构。早期人们曾利用反复冻融法、胰酶消化法等制备ADM，但由于这些方法不能完全去除真皮内细胞成分, 导致ADM移植后引起宿主强烈的排异反应, 而且制备过程也过于复杂, 因而并未广泛开展。目前ADM的制备方法主要有

DispaseII-Triton法、高渗盐-SDS法、高渗盐-酶消化法、NaOH消蚀法等。只要条件控制适度,这些方法均可制备出合乎条件的ADM

DispaseII-Triton法

皮肤标本先经DispaseII处理(2.5 U/ml溶液, 4℃下作用48 h), 再经TritonX2100处理(0.5%溶液, 室温下作用48 h)可将皮肤中的细胞彻底脱除。DispaseII主要分解IV型胶原和纤维粘蛋白, 能裂解基底膜中的致密层。DispaseII 是一种快速有效的分离表皮与真皮的酶。标本经DispaseII处理后, 表皮真皮间的基底膜及皮肤附属器官周围结缔组织成分均被破坏。DispaseII同时也破坏了纤维细胞和结缔组织基质间的连结, 更有利于TritonX2100的浸透。TritonX2100属于非离子型表面活性剂, 在溶液中稳定性高, 不易受强电解质无机盐存在的影响, 能与生物膜中的磷脂等脂质结合形成复合物,溶解于溶液中。同时, TritonX2100中的疏水端也能和膜蛋白破坏生物膜, 从而使细胞溶解破坏。该方法细胞脱除彻

底, 但同时基底膜结构破坏大, 不利于上皮细胞底黏附生长。

高渗盐-SDS法

皮肤标本先经高渗盐作用(1 mol/LNaCl溶液, 37℃下作用24h)使锚着细丝与表皮基底细胞的半桥粒分离,从而完整地去除表皮。然后在未改变胶原结构的情况下,再用破膜剂十二烷基硫酸钠(0.5%SDS溶液, 室温下作用1h)将皮肤标本中的细胞脱除。该方法细胞脱除也比较彻底,基底膜完整保留,但真皮中Ⅳ型胶原、纤维结合素、弹力素、HLA-DR等含量较多,因此具有相对高的抗原性。

高渗盐-NaOH消蚀法

该方法利用高渗盐(1 mol/LNaCl溶液, 37℃下作用24h)去除表皮，同时再利用NaOH(低浓度溶液, 室温下作用18h)中碱离子的吸水作用夺取组织细胞的水分,使细胞脱水而死亡;最后使用超声清洗仪清洗除去细胞。该方法细胞彻底脱除,胶原纤维结构完整, 排列较正常松散。但要注意控制NaOH的作用时间,如果过长(如:36h)会使胶原变性,蛋白裂解,得到的是真皮皮浆。

酶消化- 去垢剂法

该方法用胰蛋白酶(0.25%溶液,4℃下作用24 h), 接着用TritonX2100 (0.1%溶液, 室温下作用8 h), 最后用Dispase(560 units/L, 4℃下作用24 h)。Ray等[ 7] 使用胰蛋白酶(0.25%溶液, 室温下作用18 h)和SDS(0.1%溶液, 室温下作用12 h),然后用胰蛋白酶再作用12h, 最后用Dispase(560 units/L, 25℃下作用12 h), 制得的基质均无细胞成分,胶原支架完整。

脱细胞真皮基质的制备流程

1.2 脱细胞真皮基质的作用机制

脱细胞真皮基质保留了真皮与表皮之间的基底膜, 故在应用时可形成基底膜与真皮两个面。基底膜面支持移植于其表面的断层皮片的生长,对表皮细胞的分化成熟和移植皮的外观与功能起着非常重要的作用,亦有利于组织工程中种子细胞或培养的角朊细胞的黏附、扩展等。真皮面有利于ADM 在宿主内快速血管化, 为成纤维细胞的生长提供良好的支架,有助于对脱细胞真皮胶原成分的改建,促使成纤维细胞形成形态结构及排列分布正常的胶原纤维,还具有调节、诱导、

促进宿主细胞长入,促进纤维细胞增生、新生血管和上皮形成等作用。真皮成分的多寡是创面愈合后弹性、外观是否良好的重要因素, 瘢痕形成的量及挛缩程度与所植皮片中真皮的含量成反比。真皮含量不足时成纤维细胞只能合成不成熟的基质, 此种基质经改建后即成为瘢痕组织。脱细胞真皮基质作为一种真皮代替物能被宿主接纳,并被改建成为自体真皮组织,减少皮片移植后的瘢痕形成及挛缩, 能与全厚皮片移植后的效果相媲美。

1.3脱细胞真皮基质的临床应用范围

1.腹壁外科

(1)婴幼儿腹壁缺损（2）嵌顿性或绞窄性腹壁疝

（3）腹壁缺损伴有污染或感染创面（4）食道裂孔疝

（5）盆底腹膜修复（6）腹腔室间隔综合症腹腔关闭

（7）全腹壁切除或缺损的腹壁再造（8）其他复杂的腹壁修复情况

2.泌尿外科

长段尿道狭窄或缺损、先天性尿道下裂、尿瘘、膀胱扩容、肾组织修补

3.结直肠、肛门外科

(1)非急性期的单纯性高位和低位肛瘘（2）阴道前庭瘘

(3)对肛门括约肌功能影响大的肛瘘和肛周感染（4）管状消化道瘘

4口腔科

（1）口腔黏膜缺损（2）牙周手术治疗（3）腭裂修复术中修复软组织缺损5 整形外科

(1)烧伤创面及烧伤后期瘢痕挛缩畸形的修复

(2)慢性创面及病理性瘢痕的修复

(3)面部整形及美容: 矫正鼻畸形、眼睑，结膜层缺损的修复、隆唇