血清白蛋白的分离纯化及鉴定(一)-盐析、G-25脱盐、G-75层析

紫外检测仪记录仪
1、量程一定用10mv。 2、走纸速度：G25，2A，5 cm；G75,1A，1-2 cm。 紫外检测仪使用方法： 1、首先将主机和记录仪二部分电路接妥，然后把主 机的电源插头插入220V电源插座上。 2、出厂前波长设定280nm，若所需其它波长，只需 在仪器右侧转动波长转换旋钮拨到实验所需档。
不同类型的葡聚糖凝胶的分离范围和应用
凝胶类型 G-25 G-75
分离范围（Mr） 1000-5000 3000-70000
应用 去盐 中等蛋白质分离
实验步骤-硫酸铵盐析

取正常人血清2.0ml于小试管中，边摇边缓慢
滴加饱和硫酸铵溶液2.0ml，混匀后于室温中
放置10min，3000r／min离心10min。
实验注意事项

1、凝胶G-25，G-75装柱前要充分混匀；
2、凝胶G-25，G-75装柱时避免出现断层和气泡；
3、洗脱过程中，要保持洗脱液在凝胶柱中流动；

4、时刻关注蛋白值，记录收集每管的起始蛋白值。
紫外检测仪的使用
紫外检测仪主要技术指标： 量程范围：0-100%T、0-2A、0-1A、0-0.5A、0-0.2A、0-0.1A、0-0.05A 1、调节光量旋钮，量程旋钮放置100%T档，使LED数字显示为 100，T拨到A档，使LED面板上读数为0左右，若作透光度T测试，就 可在层析柱上加样，对样品进行分离分析。 2、若做光密度A测试，把量程旋钮（即灵敏度）拨到所需光密度 A，调节光量旋钮，使LED面板为0。此时记录仪回到零点附近（注： 零点附近即可，在实验中可自来定）。 3、如绘出图谱峰值过小，把量程旋钮（即敏度）拨到所需位置。 4、在测试过程中，“光量”均不再变动。测试完毕，并用蒸馏水 清洗样品池和管道。
和水膜，从而使蛋白质从溶液中凝聚沉淀析出。
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利用白蛋白和球蛋白在高浓度中性盐溶液中(常用
硫酸铵)溶解度的差异而进行沉淀分离，此为盐析
法。血清白蛋白在饱和硫酸铵溶液中沉淀析出， 血清球蛋白在半饱和硫酸铵溶液中沉淀析出。
凝胶层析
1、凝胶层析也称凝胶过滤，是一类利 用有一定孔径范围的多孔凝胶的层析 技术，是一种分子筛效应。 2、当样品流经这类凝胶的固定相时， 不同分子大小的各组分因进入网孔受 阻滞的程度不同而以不同的速度通过
凝胶柱G-75分离纯化
3、洗脱：凝胶柱经0.02 mol/L PH6.5 NH4Ac缓冲液平衡后， 慢慢打开底口使凝胶床上的液面下降到与床面相齐（不 低于凝胶床面），夹死底口。用吸管吸取样品Ⅲ，小心 缓慢的加到凝胶床面，打开底口，使样品Ⅲ慢慢进入凝 胶床面直至与床面相齐。吸取缓冲液，沿壁慢慢加入凝 胶床面，进行洗脱。 4、收集：洗脱液用部分收集器收集（或者手工操作），每 管2ml，用紫外检测仪检测蛋白峰并收集，为样品Ⅳ，绘 制洗脱曲线。
凝胶柱G-25层析除盐
3、洗脱：凝胶柱经0.02 mol/L PH6.5 NH4Ac缓冲液平衡后， 慢慢打开底口使凝胶床上的液面下降到与床面相齐（不 低于凝胶床面），夹死底口。用吸管吸取样品Ⅱ，小心 缓慢的加到凝胶床面，打开底口，使样品Ⅱ慢慢进入凝 胶床面直至与床面相齐。吸取缓冲液，沿壁慢慢加入凝 胶床面，进行洗脱。 4、收集：洗脱液用部分收集器收集（或者手工操作），每 管2ml，用紫外检测仪检测蛋白峰并收集，为样品Ⅲ，绘 制洗脱曲线。

用滴管小心吸出上层清液于另一试管中，作为
纯化白蛋白之用。
凝胶柱G-25层析除盐
1、装柱：洗净的层析柱垂直夹于铁架上（有尼龙网孔的一 头朝下），将底部夹紧，注入约2.0 ml的0.02 mol/L PH6.5 NH4Ac缓冲液。将G-25疑胶搅成悬浮状加入层析柱内， 慢慢打开柱底部出口，同时，不断加入凝胶直至柱高 25cm（装柱时速度要均匀，不能分层，不得有气泡，凝 胶床表面要平整）。 2、平衡：在凝胶柱床上留有3cm高的溶液，将层析柱底部 旋紧，用0.02 mol/L PH6.5 NH4Ac缓冲液平衡20min，(防 止柱床流干)。
层析柱，从而达到分离的目的。
凝胶层析
3、当样品通过层析柱时，分子量较大的物质因为不能或 较难通过网孔而进入凝胶颗粒间隙，沿着凝胶颗粒间 的间隙流动，所以流程较短，向前移动的速度较快， 即受阻滞的程度较小，最先流出层析柱；反之，分质
量较小的物质（硫酸铵），因为颗粒直径较小，可通
过网孔而进入凝胶颗粒，所以流程较长，向前移动的 速度较慢，即受阻滞的程度较大，流出较晚。
血清白蛋白分离与纯化
实验目的

1.了解血清蛋白质分离的一般方法 2.掌握盐析法、凝胶层析分离纯化白蛋白的方法
实验原理

血清中主要蛋白：白蛋白与球蛋白
正常人血清中总蛋白、白蛋白、球蛋白的量保
持相对恒定；总蛋白60-80克/升，白蛋白为40-
50克/升，球蛋白为20-30克/升。
盐析法

中性盐类能破坏溶液中蛋白分子表面的双电子层
紫外检测仪工作原理
仪器工作原理的依据是光吸收定律。从光源发出的光 经狭缝、滤光片、样品池到光电培增管上，使束由于样品 浓度不同所引起光强的变化转换成光电流的变化，此光电 流经放大器输入到对数转换器，使透光率T转成A输出，即 A=1g — =εCL式中ε为待测样品的克分子消光系统，C为样 品浓度，采用克分子/升单位，L为光程，用厘米作单位。 根据上式就知测出了A，就知样品浓度C。若从放大器直接 输入记录仪，绘出的是样品透光率T变化的图谱，若从对数 转换器输入到记录仪绘出的是样品光密度A变化的图谱。
凝胶柱G-75分离纯化
1、装柱：洗净的层析柱垂直夹于铁架上（有尼龙网孔的一 头朝下），将底部夹紧，注入约2.0 ml的0.02 mol/L PH6.5 NH4Ac缓冲液。将G-75疑胶搅成悬浮状加入层析柱内， 慢慢打开柱底部出口，同时，不断加入凝胶直至柱高 25cm（装柱时速度要均匀，不能分层，不得有气泡，凝 胶床表面要平整）。 2、平衡：在凝胶柱床上留有3cm高的溶液，将层析柱底部 旋紧，用0.02 mol/L PH6.5 NH4Ac缓冲液平衡20min，(防 止柱床流干)。