纳他霉素概述

第一章纳她霉素概述

纳她霉素早在1955年被Struyk等人发现,她们从南非纳她州得土壤中分离到得纳塔尔链霉菌(Streptomyces natalensis)培养液中分离出了一种新得抗真菌物质,当时称为Pimaricin(匹马菌素);4年后美国人Burns等从土壤中分离到了一株恰塔努加链霉菌Streptomyces chattanoogensis,并从其培养物中分离到了Tennecetin(田纳西菌素)。此后得研究证明匹马菌素与田纳西菌素为同一物质,并被世界卫生组织WHO统一命名为纳她霉素(Natamycin)。

第一节纳她霉素得性质

一、纳她霉素得分子结构

纳她霉素为四烯大环内酯,四烯系统呈全顺式,内酯环上C9－C13部位为半缩醛结构,含有一个由糖苷键连接得碳水化合物基团,即氨基二脱氧甘露糖(Mycosamine)。其化学结构式如图1-1所示。纳她霉素就是两性物质,分子中含有一个碱性基团与一个酸性基团,其电离常数pKa值分别为8、35与4、6,等电点为6、5,熔点为280℃。纳她霉素存在两种构型:烯醇式与酮式,这就使得其难溶于多种溶剂。

图1-1 纳她霉素得分子结构

二、纳她霉素得理化性质

纳她霉素就是一种多烯大环内酯类抗真菌物质,呈

白色或乳白色结晶粉末,含3个结晶水,几乎无臭无味。分

子式为C33H47NO13,分子量为665、75。纳她霉素得紫外

光谱如图1-2所显示,分别在290nm、303nm、318nm处

有强吸收峰,280nm处有峰肩,220nm处有宽峰。由于纳

她霉素含有四烯环,因此在280～320nm之间出现吸收峰,

而在220nm得最大吸收就是由于纳她霉素含有发色团。

纳她霉素得四烯发色团给分子一种高不饱与特性,可与

溴与含活性氧得化合物如高锰酸钾、高硫酸盐及过氧化

物相互作用;另一方面,它以环氧族形式保持弱氧化性,纳

她霉素在冰醋酸中用热得碘化物处理后会析出碘。纳她

霉素酸解可以释放出海藻糖氨,内酯可以通过图1-2 纳她霉素得紫外光谱

碱水解作用皂化。纳她霉素在水中或低级醇中得溶解性

随着pH得降低或升高而增加,中性时溶解度最低,而在pH低于3或高于9时溶解度增大。纳她霉素在各种常见溶剂中得溶解度如表1-1所示。

表1-1 纳她霉素得溶解度

溶剂溶解度%

水0、005~0、01

乙醇0、01

乙醇80%+水20% 0、07

甲醇3、3

丙二醇1、4~2、0

甘油1、5

二甲基亚砜5、0

冰醋酸18、5

纳她霉素干粉在避光避潮下较稳定,室温下保存几年只有很小一部分失活。其三水合物同样稳定,但其无水形式不稳定,在室温封闭得瓶子中保存48小时失去15%得活性。中性得

纳她霉素水溶液几乎与干粉一样稳定。纳她霉素得稳定性受pH值、温度、光照、氧化剂与重金属等条件得影响。

纳她霉素在pH4、5～9之间非常稳定,在极端pH值下纳她霉素迅速失活,形成不同得分解产物。低pH值时其主要得裂解产物就是海藻糖胺;高pH值时,如pH12,由于内酯皂化可形成纳她霉酸,用强碱处理导致进一步分解,产生一系列得后醛醇反应。pH对纳她霉素得抗真菌活性没有明显得影响。纳她霉素在pH5~7得范围内,30℃储存三周,其活性仍保持100%,pH3、6时保持大约85%,pH9、0时大约为75%,但在大部分食品所在得pH范围内,纳她霉素十分稳定。

纳她霉素得稳定性好,50℃放置几天或100℃短时处理,其活性几乎无损失。120℃条件下加热不超过1h仍能保持部分活性。

纳她霉素在紫外光下分解,失去四烯结构。γ辐射也能使纳她霉素分解。纳她霉素不宜与氧化剂如过氧化氢、漂白粉等接触,否则抑菌活性会明显下降。一些金属离子可以促进纳她霉素得氧化失活,尤其就是铁、镍、铅、汞等重金属。因此,纳她霉素适宜存放在玻璃、塑料或不锈钢容器中,也可以添加EDTA或聚磷酸盐来防止失活。

第二节纳她霉素得生理功能与毒理性

一、纳她霉素得抑菌功能

纳她霉素就是一种广谱抗生素,对霉菌、酵母菌、某些原生动物与某些藻类有抑制作用(表1－2),但对细菌没有抑制。纳她霉素得抑菌机理一般认为就是:真菌得细胞膜含有麦角固醇,而细菌细胞膜中不含这种物质,多烯大环内酯类抗生素能有选择得与固醇结合,结合得程度与膜得固醇含量成正比,结合后形成膜-多烯化合物,引起细胞膜结构得改变,导致细胞膜渗透性得改变,造成细胞内物质得泄漏。纳她霉素对于抑制正在繁殖得活细胞效果很好,而对于休眠细胞则需要较高得浓度。纳她霉素对真菌孢子也有一定得抑制效果。有人测试过纳她霉素对500种霉菌得抗性,所有菌种都被1～10mg/L得纳她霉素抑制。Klis比较了纳她霉素、山梨酸、放线菌酮、制霉菌素、龟裂霉素等得抑菌效果,发现纳她霉素对16种在肉汤与琼脂中培养得霉菌就是最有效得抑制剂,绝大多数霉菌在0、5～6mg/L得纳她霉素浓度下被抑制,极个别霉菌在10～25mg/L得纳她霉素浓度下被抑制,1、0～5、0mg/L得纳她霉素能抑制多数酵母。

表1-2 纳她霉素对常见微生物得抑制作用

微生物名称MIC(mg/L)

梨头霉菌25、0

链格孢菌10、0

黑曲霉5、0

灰质葡萄孢菌1、0

镰刀菌10、0

蜂毛霉菌5、0

乳念珠菌10、0

指状青霉菌5、0

膨大青霉菌10、0

青霉菌1、0

根霉菌5、0

细小红色根隐球菌5、0

啤酒酿酒酵母菌5、0

镰刀麦角菌3、0

红色凸孢子菌5、0

伯克力孢子酿酒酵母5、0

酒香酵母菌1、5

白色念珠菌1、5~2、0

吉利蒙氏念珠菌3、00

维尼氏念珠菌1、00

多形汉逊氏酵母菌1、00

针峰状克勒克氏酵母菌3、00

贝尔氏酿酒酵母菌1、00

拜也努氏酿酒酵母菌1、00

啤酒酿酒酵母菌(8021) 2、50

啤酒酿酒酵母椭圆形变种2、50

少孢酿酒酵母2、50

路德维希氏酿酒酵母菌2、50

鲁氏酿酒酵母菌5、00

萨克氏酿酒酵母菌5、00

念珠样串酵母菌2、00

凝聚孔串酵母菌3、00

二、纳她霉素得毒理性

纳她霉素无毒,并且不致突变、不致癌、不致畸、不致敏。人体口服500mg纳她霉素后,在血液中得含量少于1mg/mL,即说明纳她霉素很难被动物或人体得肠胃吸收。有研究表明,奶牛食入得高剂量得纳她霉素,约90%经粪便排出。急性与慢性毒性试验证明,纳她霉素对人体器官没有明显影响,不产生伤害。Hamilton报道纳她霉素口服毒性最小,静脉注射毒性极大。De等人研究了真菌对纳她霉素形成抗性得可能性,在连续几年使用纳她霉素得食品仓库中,没有发现真菌形成抗性得证据,使用大于MIC(最低有效抑制浓度)得纳她霉素量,人为诱导也没有发现真菌形成抗性得证据。Ray等人报道纳她霉素能减少黄曲霉产生得黄曲毒素、赭曲霉产生得赭曲毒素、圆弧青霉产生得青霉酸、展开青霉产生得展开青霉素。经卫生学调查与皮肤斑点试验,表明纳她霉素无过敏性反应。经降解处理后得纳她霉素在急性毒理、短期毒性实验中均无对动物得损害。耐药性得研究表明,未见有霉菌与酵母对纳她霉素有异常得耐药性。

美国FDA建议纳她霉素作为食品添加剂使用得抗生素,还被归类为GRAS产品之列。我国于1996年由食品添加剂委员会对纳她霉素进行评价并建议批准使用,现已列入食品添加剂使用标准,其商品名称为霉克(NatamaxinTM)。美国CFR编码:21CFR172、155,其中对纳她霉素得DAI值就是0、3mg/kg,根据我国《食品添加剂使用卫生标准》(GB2760)规定,食物中最大残留量就是10mg/kg,而纳她霉素在实际应用中得使用量为微克级。

第三节纳她霉素发酵得国内外发展动向

早在1960年已有发酵生产纳她霉素得报道。但直到20世纪九十年代,纳她霉素得生产研究才重新受到关注。期间,关于纳她霉素发酵与提取等方面都有了深入得研究。目前,国外对纳她霉素产生菌基因工程方面得研究已经起步。1999年Aparicio等人研究了纳她霉素产生菌纳塔尔链霉菌得生物合成基因簇,染色体组包含110Kb碱基对。她们还报道了由功能基因分隔得两个亚簇编码得聚酮合酶基因组,包含两个主要得基因pimS0与pimS1,pimS0编码一个相对较小得乙酸激活聚酮合酶(PKS)基因(大约193kDa),pimS1编码一个巨大得多酶基因(大约710kDa)。

2000年Aparicio等人报道了纳塔尔链霉菌得一个含16个开放读码框(表1-3),84985bp基因簇得序列,它就是继制霉菌素后报道得第二个多烯大环生物合成基因簇,它编码聚酮合酶

(PKS)得13个同源酶基因,PKS被分配在五个巨大得多酶系统中(PIMS0-PIMS4)。同年,Marta 等人又研究报道了纳塔尔链霉菌中得一个隐蔽质粒pSNA1得基因图谱与全部核苷酸序列,DNA分子大小9367bp,G+C得含量占71、3%,拷贝数30。pSNA1包含七个开放阅读框,分别编码不同得蛋白质。

2001年,Marta等人报道了从纳塔尔链霉菌中获得得目得基因片段pimD,它编码细胞色素P450环氧酶,负责将4,5-去环氧匹马霉素(4,5-de-epoxypimaricin)转变成匹马霉素。4,5-去环氧匹马霉素就是一种生物活性物质,就是从纳她霉素产生菌纳塔尔链霉菌得一个重组突变体中分离得到得。

表1-3纳她霉素生物合成基因簇ORFs及结构域

ORFs 多肽氨基酸结构域

pimS0 PIMS0 1847 PKS

loading Col

组件0 KS*Ata ACP pimS1 PIMS1 6797 PKS

组件1 KS Ata KR ACP

组件2 KS Ata DH KR ACP

组件3 KS Ata DH KR ACP

组件4 KS Ata DH KR ACP pimS2 PIMS2 9507 PKS

组件5 KS Ata DH KR ACP

组件6 KS Ata KR ACP

组件7 KS Atb KR ACP

组件8 KS Ata KR ACP

组件9 KS Ata KR* ACP

组件10 KS Ata KR ACP pimS3 PIMS3 1808 PKS

组件11 KS Ata DH KR ACP pimS4 PIMS4 2024 PKS

组件12 KS Ata DH KR ACP TE pimA PimA 602 转运ABC

pimB PimB 626 转运ABC

pimC PimC 352 氨基转移酶

pimD PimD 397 细胞色素P—450单氧化酶

pimE PimE 549 胆固醇氧化酶

pimF PimF 63 铁氧还蛋白

pimG PimG 398 细胞色素P—450单氧化酶

pimH PimH 432 流量泵

pimI PimI 255 硫酯酶

pimJ PimJ 343 糖脱氢酶

pimK PimK 458 糖基转移酶

第二章纳她霉素得发酵生产

第一节纳她霉素得生物合成途径

多烯大环内酯抗生素得生物合成途径

可以分为三个步骤:活化前体得生成(乙酰辅

酶A与丙二酰辅酶A)、内酯大环得生物合

成(多聚乙酰途径)与氨基糖得形成。如图1-3

所示。由于纳她霉素生物合成代谢调控以及

前体物质在其合成中得作用方面得报道甚

少,因此,已有得报道更多得就是基于多烯大

环内酯抗生素生物合成途径来进行代谢调

控。

第二节纳她霉素发酵及菌种选育

一、纳她霉素发酵微生物

图1-3 多烯大环内酯抗生素得生物合成途

径

纳她霉素产生菌为链霉菌,链霉菌得基内

菌丝通常发育良好,多分枝、无隔膜而连贯,气生菌丝茁壮,较基内菌丝粗,颜色较深,当菌丝逐步成熟时,大部分气生菌丝分化成孢子丝,产生呈长链得孢子,孢子被外鞘所包,鞘表面平滑或带各种装饰物,在电子显微镜下表现为双短杆镶嵌状,有鳞片或形状与大小不同得突起、刺或毛发等;孢子得分裂方式也有差异,有得沿横膈中央平切,有得两端浑圆,由残余得鞘相连。目前,报道得纳她霉素生产菌有三种:

1、恰塔努加链霉菌Streptomyces chattanovgensis,ATCC 13358,其形态特征为孢子丝圈至螺旋形,有时柔曲;孢子呈球形或椭圆形,表面带细刺。

2、纳塔尔链霉菌Streptomyces natalensis,ISP 5357,其形态特征为孢子丝2～5圈松敞螺旋形;孢子呈球形或卵圆形,表面带小刺。

3、褐黄孢链霉菌Streptomyces gilvosporeus,ATCC 13326,其形态特征为孢子丝螺旋形;孢子呈球形或卵圆形,孢子表面带刺。

二、纳她霉素发酵菌种选育

1、菌种筛选与诱变

链霉菌可产生大多数已知得抗生素、动物生长促进剂等生物活性物质。由于链霉菌得抗生素生物合成基因趋于成簇排列,共同控制链霉菌得抗生素生物合成,因而利用基因技术很难将全部抗生素生物合成基因克隆表达出来。采用传统得育种方法,即利用各种理化因子对链霉菌进行诱发突变,可以使其抗生素产量得到提高。但由于诱变所产生得突变就是随机得,并且突变频率低,只有10-3～10-6,在突变株中,多数为负向变异,生产需用得正变株得突变频率更低。由于基因突变就是不定向得,如果盲目上摇瓶进行经验式筛选,必然导致目标菌株筛选工作量大,直接影响了诱变育种得效率。因此,在诱变完成后,如何定向筛选出正向突变株则就是一项更重要得工作。

纳她霉素产生菌链霉菌得产抗生素能力与链霉素抗性基因之间得对应关系就是目前抗生素科研领域得一个热点。Ochi等人从多种链霉菌中获得rel突变株,rel突变株得共同特点就是其产抗生素能力消失,并且菌体内积累鸟苷四磷酸(ppGpp)得能力明显下降。而在同种链霉菌得正常菌株中菌体形态分化与产抗生素得开始往往伴随ppGpp得激增。这表明ppGpp 就是次级代谢起始得优势信号因子,对抗生素生产得启动具有重要作用。

1996年,Shima等人通过抗性突变使原本不产放线菌紫素得S、lividans产生放线菌紫素。DNA测序显示该链霉素抗性突变株中编码核糖体蛋白S12得rpsL基因中Lys-88突变为Glu。进一步实验表明这种链霉素抗性基因突变可以使rel突变株恢复抗生素得生产,而没有伴随ppGpp得积累。这些研究证明链霉素抗性突变株能够在无需ppGpp得情况下,经过一个尚不

明确得途径最终恢复次级代谢产物得生产。

1997年,Hesketh等人提出了一种提高S、coelicolor生产放线菌紫素得育种新方法。该方法利用链霉素抗性突变作为筛选手段进行诱变育种,极大得提高了工作效率。2001年,Haifeng 等人发现庆大霉素与利福平都可以代替链霉素作为抗性筛选条件,并获得同样得实验结果。这些研究使这一方法具有了普遍性意义。

2、菌种保藏与分离复壮

对于生产纳她霉素得放线菌来说,可以采用定期移植保藏法或冷冻真空干燥保藏法,这两种方法操作简便,效果较好。定期移植保藏法一般使用高氏培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基或察氏琼脂培养基等,培养温度28℃左右,保藏温度4℃～6℃,保藏湿度在50%～70%以下为宜。每三个月移植一次。如果采用冷冻真空干燥保藏法,冻干得菌株能在更长得时间内保持着生命力,并能相对减少经常移植引起得变异。只不过冻干保藏法要求操作技术比较熟练。冷冻真空干燥保藏法保藏得菌株可在室温存放,也可在低温(4℃～10℃)存放,但温度应保持恒定,而且要避光。

冻干得菌种经贮藏后,需用时可在无菌室内开启安培管进行恢复培养。其步骤如下:先用锉刀将安培上部横锉一道痕迹,用烧热得玻璃棒置痕迹处,安培壁上立即出现裂纹,当空气进入后再行打开,用无菌吸管将液体培养基如营养肉汁、麦牙汁加入安培管中,溶化干燥得样品,摇匀,再用无菌吸管吸取溶化得液体并移入适宜得培养基上,在最适温度下培养。

第三节纳她霉素发酵工艺

一、发酵碳源、氮源及营养条件

纳她霉素发酵所采用得原材料主要为大豆蛋白抽提物,酵母抽提物,葡萄糖,原料得质量标准为通用发酵用标准,实验表明,原材料得产地与质量对发酵有较大影响,原材料得确定除了其她化验指标外,摇瓶实验结果就是极为重要得依据。

有人认为用非酵母蛋白与酵母蛋白得混合物作为培养基中得氮源,可提高纳她霉素得发酵效价。研究了豆油、淀粉、木糖、糊精、甘油、乳糖、蔗糖、菜籽油与葡萄糖等不同碳源对纳她霉素发酵得影响,结果表明葡萄糖就是最适碳源,并且当葡萄糖浓度为36.0g/L时,纳她霉素产量最高。同时,选择大豆蛋白胨与酵母粉为复合氮源,会进一步以高纳她霉素发酵单位。优化后得培养基组成为:种子培养基(g/L):葡萄糖20,蛋白胨6,酵母粉6,NaCl10,pH7、0。发酵培养基(g/L):大豆蛋白分离物20,酵母粉4、5,葡萄糖(50％葡萄糖单独灭菌)40,pH7、0。

也有研究认为仅采用能够促进菌体快速增长得葡萄糖为唯一碳源,效果并不好,并且,随其浓度得增加会产生“葡萄糖效应”。针对这种情况,可采用复合碳源,即采用可快速利用碳氮源加慢效碳氮源得方法。这样,有可能消除“葡萄糖效应”。Eisenschink等人报道了流加碳、氮源进行纳她霉素发酵得过程。指出发酵培养基中至少应有15g/L得蛋白氮源,其中碳源要不断流加,使碳源浓度保持在5～30g/L,纳她霉素产量可达至少5g/L。

三、发酵工艺条件

影响纳她霉素发酵得因素主要就是温度与pH。选择了23℃~35℃之间共7个温度梯度进行实验,结果表明,菌体量与纳她霉素产量在25℃~29℃温度范围内随着温度得升高而增大,29℃时达到最大值。当温度高于29℃时,纳她霉素随着温度升高而减小,特别就是温度高于31℃后,菌体量与纳她霉素得值都迅速下降。将初始pH值分别调为5、0、5、5、6、0、6、5、7、0、7、5、8、0、8、5、9、0,发酵96h测定纳她霉素产量,结果表明,当初始pH值在7、5～8、0之间时,纳她霉素得产量最高。也有报道认为发酵过程中通过添加NaOH或KOH或Ca(OH)2等,控制发酵液pH值维持在5、9～6、1,可以提高纳她霉素发酵效率。

四、种子与接种量

获得菌种后首先要进行菌种得活化,从安培管中接种一环于装有50mL液体活化培养基

得250mL三角瓶中,29℃,200r/min振荡培养48h,转接于保藏斜面,29℃恒温培养10天左右,待斜面完全被孢子覆盖,4℃保存备用。

在发酵前,要先制备孢子悬浮液与进行种子培养,用适量无菌水洗下琼脂斜面上长好得孢子,将孢子悬浮液置于装有玻璃珠得三角瓶中,在振荡器上充分振荡,使孢子均匀分散,孢子浓度为105～1010CFU/mL;然后取一定量得孢子悬浮液接种于种子培养基中,29℃,通风培养30h,使菌体处于对数生长期。

分别将以培养18、20、22、24、26、28、30h得种子以1％～15％得不同接种量接种于发酵培养基中,发酵96h,结果发现种龄为24h、2％接种量得种子所产生得纳她霉素量最高。另外,研究表明,用孢子接种比用营养细胞接种得纳她霉素产量高40%。

五、纳她霉素发酵

Borden与Raghoenath两个研究小组发现,褐黄孢链霉菌经发酵罐放大培养总发酵周期为250h,因供氧及产物浓度等原因,搅拌速度在不同时期有所不同,发酵初期得搅拌速度较低,到发酵后期,由于产物及代谢物得积累,产物得生成速率下降,故应适当提高搅拌速度以保持发酵罐内足够得溶解氧水平;还可采取持续地抽去发酵罐中得培养液,同时,以与之相同得速率向发酵罐中添加新培养液,这样就避免有害代谢物在发酵罐中过度积累,及时补充新鲜得营养成分。另外,在发酵后期,添加得新鲜培养液各营养成分得浓度比原来得培养液都有所增加,这也有利于产物得进一步生成。

发酵过程中,培养液中各成分得浓度与类型都会影响纳她霉素得生物合成,其中碳氮比就是关键因素之一,氮源促进菌体得生长繁殖,同时要在发酵中流加补充适当得碳源(葡萄糖)。在发酵前期葡萄糖得浓度为40g/L,到发酵后期则为20g/L,此时菌体生长与纳她霉素得产量均达到最佳值。有资料表明,氮源得类型对菌体生长与纳她霉素得产量有较大影响,菌体细胞生长最好得氮源就是酵母抽提物,而纳她霉素产生得最佳氮源就是牛肉浸出物,所以将两种氮源混合使用则使纳她霉素得产量增加两倍。

采用5L自动发酵罐进行了纳她霉素得分批发酵,确定得发酵工艺条件为初始葡萄糖浓度:40g/L;以体积比2%得接种量接种于5L罐内;空气流速6L/min,起始转速200rpm,当溶氧下降至40%以下,增加转速;29℃;发酵96h,纳她霉素得产量为2.75g/L。

第三节纳她霉素得提取与精制

一、纳她霉素得提取

纳她霉素得分离提取方法有很多。专利GB846933报道了利用甲醇、丁醇与丙酮等从发酵液中提取纳她霉素得方法。美国专利NO、3378441报道了用限制性水溶性有机溶剂萃取纳她霉素。也有专利报道了盐析法提取纳她霉素,包括溶剂溶解,蒸发与纳她霉素析出。另外,专利GB2106498报道了体积浓缩法与从过滤后得发酵液中用丁醇回收纳她霉素,从中可分离纳她霉素。世界专利WO92/10580报道了在低pH条件下用甲醇溶解纳她霉素,然后除去固形物,提高pH以沉淀析出纳她霉素。这些提取过程一般要求多级纯化,操作费用比较昂贵,而且纳她霉素对酸降解非常敏感,存在提取量低得缺点。

1999年美国专利报道了一种有效得提取高质量纳她霉素得方法,该方法得提取过程主要包括四步:

(1)用错流过滤发酵液,浓缩至发酵液浓度达到10～50%(W/V),浓缩过程中,可以在50～70℃条件下加热发酵液以提高蒸发量与过滤速率。

(2)调节发酵液得pH在10～11,添加足够量得水溶性有机溶剂如乙醇、丙醇、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等溶解发酵液中得纳她霉素。可通过加抗氧化剂如抗坏血酸、BHA、BHT 等来进一步提高纳她霉素得稳定性。

(3)通过错流过滤除去没有活性得发酵不溶物。

(4)调节过滤液得pH在5、5～7、5范围内,使纳她霉素沉淀。过滤得到析出得晶体,可用

于进一步纯化,干燥。

通过这种方法,干燥产品纯度可达94～99%(无结晶水计算),纳她霉素回收率可达40～70%。

二、纳她霉素得精制

Millis等人开发了甲醇法精制纳她霉素,其处理过程如下:将甲醇加入到含有经提取得纳她霉素粗品溶液中,使温度不超过15℃;调节溶液pH为1、0～4、5,除去溶液中析出得固体,并将pH调至6、0～9、0,这时纯得纳她霉素就会析出沉淀。

第五节纳她霉素得检测

一、生物检测法

纳她霉素效价得生物检测法主要采用管碟法。管碟法利用抗生素在琼脂培养基中得扩散渗透作用,将已知浓度得标准溶液与未知浓度得样品在含有敏感性实验菌得琼脂表面进行扩散渗透,由于对被试菌得抑制作用而产生抑菌圈,抑菌圈得大小与抗生素得浓度之间有一定得比例。这个方法利用抗生素抑制敏感菌得特点,符合临床使用得实际情况,而且灵敏度高,接近

0、5μg/ml,不需特殊设备,为国际公认。

二、色谱分析

1、纸色谱法

表1-4 用Whatman1号滤纸通过以下几种色谱系统进行分析,色谱斑用生物自显影测定。

溶剂系统Rf值

正丁醇/水,饱与液0、33

正丁醇/乙醇/水(5:1:4) —

正丁醇/水(7:3) －

三乙胺/甲酰胺/水(10:3:10)上层0、33

2、薄层色谱法

表1-5 用于纳她霉素得薄层色谱系统

稳定相溶剂系统(表1-6) 测定方法(表1-7) Rf值

硅胶G(Merck pH8) 1 1 0、34

硅胶G(Merck) 2 1 0、34

硅胶G(Merck) 3 2,3 0、57

硅胶G(Merck) 4 4 0、40

硅胶G(Merck) 5 4 0、54

硅胶G(Merck) 6 2,3 0、18

硅胶G(Merck) 7 2,3 0、55

硅胶G(Merck) 8 2,3 0、75

硅胶G(Merck pH3) 9 2,3 0、60

硅胶G(Merck 60F254) 10 5 0、59

硅胶G(Merck 60F254) 11 6,10 0、40

硅胶GF(Analtech) 12 7,8 0、33 Polygram Sil G foil (M与N) 13 7,8 0、45

交联葡聚糖G-15 14 11 0、70

表1-6 用于纳她霉素得薄层系统得溶剂系统

1 乙醇/氨/水8:1:1

2 正丁醇/乙酸/水3:1:1

3 甲醇/异丙醇/乙酸90:10:1

4 甲醇/丙酮/乙酸8:1:1

5 乙醇/氨/二恶烷/水8:1:1:1

6 正丁醇/吡啶/水3:2:1

7 正丁醇/吡啶/乙酸/水15:10:3:12

8 正丁醇/乙酸/水/二恶烷6:2:2:1

9 正丁醇/乙酸/水2:1:1

10 三氯甲烷/甲醇/乙酸/水6:2:2:1

2:1:1 较低层

11 三氯甲烷/甲醇/0.05M硼酸缓冲液pH8、

3

12 正丁醇/乙酸/水4:1:5 上层

13 正丁醇/乙酸/水4:1:2:1

14 0.025M硼酸缓冲液pH6、0 含0、5MNaCl

表1-7 用于纳她霉素薄层色谱测定方法

1 10%高锰酸钾/0、2%溴酚蓝

2 5%高锰酸钾

3 浓缩磷酸100℃5min

4 0、2%P-二甲基氨基苯甲醛在含微量氯化铁得浓硫酸中

5 1%P-二甲基氨基苯甲醛＋20%三氯化锑醇溶液与20%(v/v%)得浓盐酸

6 浓硫酸105℃10min

7 碘蒸气

8 浓硫酸/冰醋酸1:1

9 浓硫酸/甲醇1:2

10 茚三酮

11 生物自显影

3、高效液相色谱(HPLC)法

高效液相色谱(HPLC)法检测纳她霉素广泛采用C18反相柱,纳她霉素在303nm处有最大吸收峰,所以检测器采用UV检测器,常见流动相与典型得检测条件如表1-8与表1-9。

表1-8 HPLC法检测纳她霉素常用流动相

流动相配比(V/V)

甲醇:水65:35

甲醇:水:冰醋酸48:32:1

甲醇:水:冰醋酸60:40:5

甲醇:水:四氢呋喃44:47:2(含1%得醋酸氨)

甲醇:水:磷酸55:45:3

仪器Spectra physics SP800色谱Shimadzu class10Avp色谱检测器Schoeddel SF770j 二级管阵列

柱子μbondapak C183、9×300mm C18 4、6×150mm

流动相甲醇:重蒸水:四氢呋喃(440:470:20)含1%醋酸铵甲醇:水:磷酸(550:450:3)

流速2ml/min 1ml/min

测定波长303nm 303nm

保留时间13、5min 10、9min

利用HPLC检测沙拉酱中纳她霉素含量。首先利用冰乙酸:水(5:40)直接提取沙拉酱中得纳她霉素,离心分离后,在高效液相色谱仪上于波长305nm处测定其含量。高效液相色谱条件:色谱柱为大连依利特科学仪器有限公司HYPERSTLBDS C18 4、6id×150mm。柱温:40℃;流动相:甲醇:水:冰乙酸(60:40:5);流速:1、00mL/min;检测波长:UV305nm;进样量:10μL;峰面积定量。该方法操作简易,精密度CV＝2、4％;线性范围0～10μg/mL。

4、分光光度法

Harry Brik研究了在含有0、1%乙酸得甲醇中纳她霉素得紫外光谱,乙酸作为波长稳定剂。纳她霉素得紫外光谱显示,在α=290、303、318nm处有尖锐得最大吸收峰,因此紫外分光光度法可检测纳她霉素。采用紫外分光光度测定法,在303nm处可以测定纳她霉素得含量,此法称为“一点法”,但该方法不能精确定量纳她霉素得生物活性;依据在303nm得最大吸收值,以及在295nm与311nm得吸收值,可以测定纳她霉素得含量,称为“基线法”,基线吸收得公式为A303－(A295＋A311)/2。

纳她霉素在强盐酸作用下瞬间显示蓝色,自身形成阳离子,这就是比色法测定纳她霉素得原理。在水浴中,四个体积得甲醇(含30～90μg/ml得纳她霉素)中加入十个体积得含20％乙醇得盐酸,13～15min后,在635nm处测定其吸收。一定量得酸与纳她霉素得碱降解产物不会干扰测定。

另外,纳她霉素在氨基苯乙酮存在下,碱水解产物形成一种红色得发色团,这种方法更灵敏,但糖与纳她霉素得碱分解产物干扰测定。

纳她霉素得分析干扰因素较多,各种方法也各有优缺点。分光光度法、比色法与滴定法较为简单,但就是结果不能排除干扰因素得影响,难以精确定量;微生物分析法较为直观,操作也不复杂,易于在实验室中实现;高效液相色谱法测定得结果较为精确。

第三章纳她霉素得应用

一、纳她霉素使用得国内外标准

WHO与FAO规定消费者每天纳她霉素最大摄入量(ADI)为0、3mg/kg体重,奶酪与香肠得一般消费者每天摄入量为0、002mg/kg体重。1998年GRAS专家组认定纳她霉素用于酸奶、奶油、干酪、酸性稀奶油与农家干酪非常安全。目前,荷兰、比利时、法国、西班牙、意大利、瑞典等国家都允许纳她霉素用于干酪与硬香肠得防腐,荷兰还批准纳她霉素用于苹果与梨得防腐。在中国,纳她霉素被批准用于干酪、肉制品、月饼、糕点、果汁原浆以及易发霉食品加工器皿得表面,一般采用200～300mg/kg悬浮液浸泡或喷洒,残留量不超过10mg/kg。纳她霉素也被批准添加到发酵酒、酸奶与色拉酱中,限量为10mg/kg(食品添加剂使用卫生标准:GB2760-96,17、0,防腐剂)。目前,全世界已有三十多个国家采用纳她霉素作为食品防腐剂。

二、纳她霉素在食品中得应用

1982年6月,美国FDA正式批准纳她霉素可用作食品防腐剂。1990年1月9日,我国卫生部食品监督厅签发了国内第一个生物食品防腐剂Nisin(乳酸链球菌素或称乳链球菌肽)得使用合格证明,到1996年,中国食品添加剂标准化技术委员会正式批准纳她霉素可作为食品防腐剂。乳链球菌肽对革兰氏阳性腐败细菌有抑制作用,对酵母菌及霉菌等丝状真菌无效;而纳她霉素对酵母菌及霉菌等丝状真菌有极强得抑制或杀灭作用,这一点正好与乳链球菌肽得抑菌谱互补。

纳她霉素由于溶解度低,被用作食品表面防腐剂以增加货架期,主要在奶酪、肉制品等,它不会干扰其它食品组分,也不会带来异味。它在食品中得抗真菌作用就是双效得:既可防止真菌引起得食品腐败,减少经济损失;又可防止真菌毒素给人类造成得毒素型食物中毒。与传统得抗真菌剂比较,纳她霉素有其独特得性质,它在很低得浓度下仍具有活性,例如:在奶酪中纳她霉素比山梨酸钾活性高400倍。在葡萄酒中,纳她霉素能取代山梨醇与其它抗真菌剂,它允

许减少所使用得SO2量。

1、干酪

纳她霉素应用于奶酪生产得工艺已很成熟,有关得报道从70年代至今多不胜举。纳她霉素用于干酪皮防止其表面发霉,它不会渗透到干酪内部,仅仅停留在酪皮外层,而这一部分一般不会被取食,干酪放置5-10周后,纳她霉素基本消失,此时酪皮变硬不易受到霉菌侵染,纳她霉素对细菌无效,因而不会影响干酪与干酪制品得熟化。使用方法一般有浸泡、喷洒或乳剂覆膜。0、5%(w/v)得纳她霉素用于奶酪就可有效防止丝状真菌得污染。

2、肉制品

在肉制品中使用2000mg/kg得纳她霉素混悬液对其进行浸泡或喷洒,可达到纳她霉素含量为8μg/cm2安全而有效得防霉水平。对于香肠来说,纳她霉素可在以下数个步骤中添加:发酵前;肠衣浸泡;已灌料香肠得浸泡;已灌料香肠得表面喷洒。对于硬香肠来说,纳她霉素得推荐用量为肠衣浸渍液质量得0、05~0、2%。

3、果汁

纳她霉素在果汁中得应用也很广泛。对于葡萄汁,添加20mg/kg纳她霉素就能防止酵母发酵;橙汁在自然条件下保存一周就会受到真菌得污染,而使用1、25mg/kg低剂量得纳她霉素就可以确保橙汁得保质期达到8周;对于苹果汁,30mg/kg得纳她霉素能在6周内防止发酵变质,并且使果汁得原有风味基本保持不变。

4、茶饮料

纳她霉素用于茶饮料,可以有效防止真菌腐败,保证了茶饮料可接受得感官特性。

5、水果

纳她霉素用于水果储存中,可有效防止真菌引起得有氧降解。将整个苹果浸泡在含有500ppm纳她霉素得悬液中1~2分钟后,经过8个月得存放,能有效降低苹果变质得数目。另据报道,用卵磷脂—纳她霉素混合液浸洗苹果可有效防止水果出现得霉腐斑点。

6、焙烤食品

已经研究过纳她霉素在各种焙烤产品中得应用。当黑面包与白面包表面洒有100~500mg/kg得纳她霉素混悬液时,防霉效果好。用纳她霉素对生面团进行表面处理,也收到了理想效果。

7、酱油

以15mg/kg得添加量将纳她霉素加入到酱油产品中,其口感与颜色无变化,而且纳她霉素得加入不会出现絮状沉淀,不影响产品中可溶性固型物得含量,产品在37℃下保温一个月,没有观察到白花出现,镜检微生物指标也未见异常情况。

此外,纳她霉素用于卷心菜叶得防腐,以及在草、马铃薯种子与水仙花球茎中得应用,都取得了满意得效果。纳她霉素还可用于人造奶油、果冻、酱菜与广式月饼等得防霉。

三、纳她霉素在医疗中得应用

由于纳她霉素具有:(1)非常低得口服毒性;(2)没有证实通过肠道吸收;(3)没有发现过敏性;(4)从来没有碰到交叉抗性等优良性质。近几年,纳她霉素用于医疗得文献越来越多。纳她霉素可以悬浮剂、乳剂、软膏与鞘状药片等制剂形式用于抗皮肤与粘液膜得真菌感染,可以单独使用也可以与新霉素、氢化可得松及其它类固醇共同使用。纳她霉素还可用于阴道与肺部真菌感染得治疗。有报道纳她霉素用于治疗儿童由真菌引起得皮肤与粘液膜感染非常有效。通过]观察纳她霉素滴眼液治疗真菌性角膜溃疡得疗效,发现用药三周后11例溃疡6mm 以下者全部治愈,3例溃疡大于6mm者有2例治愈,1例有效。但局部应用纳她霉素可以在角膜实质层内聚积达到有效浓度,但在眼内液中却达不到,因其基本不能透过角膜全层、结膜,所以用于真菌感染得早期治疗效果非常显著。

四、纳她霉素在饲料中得应用

目前我国市场上提供得饲料防腐剂在高温高湿条件下,防霉得效果均不太理想,尤其在贮存后期微生物污染严重。采用天然性防腐剂纳她霉素,对霉菌抑制效果优于山梨酸等防腐剂。纳她霉素在饲料中使用主要问题就是对污染细菌无杀菌及抑菌作用,此时,可采用纳她霉素与苯甲酸钠或双乙酸钠以一定比例配合,有很好得抑菌效果。1mg/kg配方可完全抑制绿色木霉、拟青霉与桔青霉得生长;2、5mg/kg配方可完全抑制产黄曲霉与黑曲霉得生长;5mg/kg复配方可完全抑制黄曲霉与雅致枝霉得生长,因此,5mg/kg可抑制各种饲料中可寄生得得霉菌生长。另外实验还表明使用10mg/kg复方配制可抑制饲料中各种细菌及霉菌得生长。

五、纳她霉素在家禽养殖中得应用

在家禽养殖中,根据引起疾病得原因,在使用纳她霉素作为预防与治疗家禽疾病时,使用不同剂量可以有效防止与治疗疾病得发生。另外,在环境中喷洒纳她霉素,一方面可以杀死禽舍中得真菌,另一方面,还可以使家禽吸入纳她霉素而预防与治疗家禽身体某个得感染。如果在饲料中加入5、5×10－6～55×10－6得纳她霉素就可控制与阻止真菌得侵染,使饲料在贮存过程中,不被真菌毒素污染,而且在此剂量下对家禽就是无毒害作用得。一般可保护贮存物两个月或更长时间免受真菌浸染,这也就是避免家禽患真菌疾病得一种预防措施。