链霉菌2754发酵产物的分离提取及结构鉴定
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13 14
中国抗生素杂志2011年6月第36卷第6期
δcª 68.36 64.87
28.72
143.79 184.23 133.33 125.1 137.42 119.81 162.6 116.06 189.91. 147.17 19.66 41.21
172.97 32.19
表2 2754C的氢谱和碳谱数据
13C-NMR、1H-1H COSY、HMBC的各峰归属见表2。
结合DEPT，HSQC谱综合解析确定为已知化合物
nanaomycin αA。结构式见图2。
2.4 活性测定
2.4.1 VEGFR-2的抑制活性
活性测定采用酶联免疫吸附测定法(ELISA法)。
. 414 .
Position 1 3 4 4a 5 5a 6 7 8 9 9a 10 10a 11 12
cª
H(mult, J(in Hz))b
66.94
5.03(1H, q, J=7.2)
3
66.08
4.11(1H, m)
2.36(1H,dd, J=1.8, J=19.2)
4
28.40
2.75(1H,dd, J=3, J=19.2)
4a
142.64
5
183.11
5a
131.75
6
124.46
7.25(1H, d, J=7.2)
链霉菌2754发酵产物的分离提取及结构鉴定 刘祺等
1.2 培养基 斜面培养基(%) ：葡萄糖 0.5，酵母粉 0.5，牛肉
膏 0.5，胰蛋白胨 0.5，玉米浆 0.4，黄豆饼粉 1.0， CaCO3 0.4，琼脂 2。
种子培养基与发酵培养基(%)：葡萄糖 0.5，酵 母粉 0.5，牛肉膏 0.5，胰蛋白胨 0.5，玉米浆 0.4， 黄豆饼粉 1.0，CaCO3 0.4，pH7.2。 1.3 实验试剂
图3 2754B和2754C对 VEGF-R2/KDR的抑制率 Fig. 3 Inhibition of VEGFR-2/KDR by 2754B and 2754C
活性测定采用2倍稀释法。 由表4可知2754B与2754C对卡介苗和结核分枝 杆菌H37Rv具有较强抑菌活性。 3 讨论 根据已知文献记载七尾霉素类化合物具有抗真 菌，抗衣原体活性，同时还具有一定抗革兰阳性 菌，抗疟疾活性未见有抗结核活性报道[7,9]。本文通 过KDR酪氨酸激酶抑制剂筛选模型首次发现化合物
X-5大孔吸附树脂 葡聚糖凝胶LH20 (上海生化 试剂厂进口，分装) 所用试剂均为色谱纯。 1.4 实验仪器
紫外光谱仪：Shimadzu UV 2550；红外光谱 仪：美国热电公司(Thermo)傅里叶变换红外光谱图 仪nicolet5700核磁共振仪：日本电子制GSX24000 型；质谱仪：BIFLE X Bruker Inc；高效液相色谱仪: Agilent 1200A；高效液相色谱柱: 柱型号为Inertsil ODS22(416mm×150mm，5Lm)；中压液相色谱 仪：FMI-C(YAMA ZEN CORP)；中压液相色谱柱： ODS-A 120-S 30/50m 10mm×500mm。旋转蒸发仪 (BüCHI 2011, 瑞士)。 2 方法与结果 2.1 C2754的发酵
7
7.59(1H,t,J=7.2)
6,8
7.52(1H,d,J=7.2)
7
1.49(3H,d,J=7.2)
1
2.53(1H,dd,J=4.2,J=15.6)
3
2.66(1H,dd,J=8.4,J=15.6)
3
3.66(3H,s)
HMBC 3,11
4a,10a,12 1,4 4 7
5,8,9a 9,5a 6,7,9a 7,8 6,8
8
9
9a 10a 10
1
O2
7
6
5a
5 4a 4
3
12 13
OH
O
图1 2754B的结构
Fig. 1 Structure of 2754B
2.3.2 2754C
2754C为黄色无定形粉末，易溶于甲醇，乙
睛，二甲基亚砜，不溶于水。对酸，弱碱稳定，
热稳定性好。ESI-MS[M+H]+(m/z)：317.1；ESI-
将生长于新鲜斜面的C2754菌种接种于种子培养 基摇瓶中，28℃旋转振荡48h。以5%接种量转种于 发酵培养基(500mL)摇瓶中，于28℃往复振荡96h， 菌丝生长良好且呈棕色时收获。
2.2 提取分离 将C2754发酵液过滤, 滤液调pH至7.0，通过X5
型大孔吸附树脂，弃去流出液，分别用无盐水、
1,4,11 1,10a 4,13 4,13
14
OH O 11CH3
8
9
9a
10a 10
1
2 O
O
7
6
5a 5 4a 4 O
3
12 13 O1C4H3
图2 2754C的结构
Fig. 2 Structure of 2754C
抑制率按如下方法计算： 抑制率=(A450对照-A450样品) /A450对照×100%。 由图3可知2754B与2754C 对VEGFR-2有较强酶 抑制活性。 2.4.2 抗菌活性测定 活性测定采用2倍稀释法。由表3可知2754B与 2754C对抗甲氧菌金色葡萄球菌(MRSA)和金色葡萄 球菌(SA)有一定抑菌活性，对枯草杆菌(BS)和铜绿 假单胞菌(PA)活性较弱或无活性。 2.4.3 抗结核活性测定
. 412 .
中国抗生素杂志2011年6月第36卷第6期 文章编号：1001-8689(2011)06-0412-04
链霉菌2754发酵产物的分离提取及结构鉴定
刘祺 蒋忠科 郭连宏 张洋 吴剑波 姜蓉*
(中国医学科学院&北京协和医学院 医药生物技术所，北京 100050)
摘要：目的 从链霉菌2754中提取分离和纯化小分子VEGF受体抑制剂，并进行结构鉴定。方法 以酪氨酸酶活性测定方 法(ELISA法)为活性跟踪方法，利用大孔吸附树脂反相HPLC等方法进行分离纯化。利用光谱分析，进行结构解析。结果 分离 纯化到两个七尾霉素类化合物nanaomycin αA和nanaomycin αA并具有相关活性。结论 Nanaomycin αA和nanaomycin αA为已知 化合物，首次报道该化合物具VEGFR拮抗活性。
3256，2967，2932，1642，1616，1461，1287，
. 413 .
1268，1059，1016，759。 2754B的1HNMR和13C-NMR各峰归属见表1，与
相关文献对比其为nanaomycin A[8]，结构式见图1。
Position 1
表1 2754B的氢谱和碳谱数据
Tab.1 NMR data of 2754B in CDCl3
C2754菌株由中国医学科学院医药生物技术研究 所菌种中心提供。
收稿日期：2011-03-01 基金项目：本研究获得2009年中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金和科技部十一五“重大新药创制”科技重大专项-综合性新 药研究开发技术大平台(2009zx09301)资助。 作者简介：刘祺，男，生于1984年，在读硕士研究生。*通讯作者，E-mail：jr5602@yahoo.com.cn
睛，二甲基亚砜，不溶于水。对酸，弱碱稳定，
热稳定性好。ESI-MS [M+H]+(m/z)：289.3；ESI-
MS[M+Na]+ (m/z)：311.3，确定分子量288，分子
式C16H16O5。紫外吸收峰: λMeOHnm(logε)207，246，
272，420。红外光谱IR
v max
(KBr)cm-1：3327，
(Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences &Peking Union Medical college, Beijing 10050)
Abstract Objective To isolate, purify and determine the structure of inhibitors of VEGFR. Methods We use the ELISA method to find compounds, and Macroporous Resin, RP-PCR to isolate and purify compounds. The structure was determined by spectral analysis. Results Obtained two nanaomycin analogues: nanaomycinαA and nanaomycin βA, both of them have bioactivities. Conclusions NanaomycinαA and nanaomycin βA are known compounds . It is firstly reported about its antagonistic activity of VEGFR.
7
136.27
7.62(1H, d, J=7.2)
8
119.17
7.59(1H, d, J=7.2)
9
161.56
9a
114.75
10
188.46
10a
146.15
11
19.72
1.59(3H, d, J=7.2)
12
37.54
1.92(2H, m)
13
60.58
3.87(2H, m)
OH O 11CH3
30%丙酮、50%丙酮和80%丙酮洗脱。取80%丙酮
洗脱液，浓缩上HL-20凝胶柱，用100%甲醇洗脱，
分段收集流出液并于HPLC检测(流动相条件：水:乙
腈=50:50，流速：0.5mL/min)，分别在tR=16min和 tR=24min时有两个黄色组分。 2.3 性质及结构鉴定
2.3.1 2754B 2754B为黄色无定形粉末，易溶于甲醇，乙
MS[M+Na]+(m/z)：339.1，确定分子量316，分子式
C
17H
16O
。
6
紫外吸收
峰
:
λ n MeOH m
(logε)207，247，
272，420。红外光谱 IRvmax(KBr)cm-1：3081，2987，
1729，1643，1616，1458，Fra Baidu bibliotek366，1296，1270，
1248，1108，1075，847，752。2754C的1HNMR、
2754B 2754C 阳性对照
表3 2754B和2754C的抗菌活性 Tab. 3 Antibacterial activity of 2754B and 2754C
MRSA/(μg/mL)
关键词：VEGFR；C2754；分离纯化；结构鉴定 中图分类号：R979.1 文献标识码：A
Isolation, purification and structure identification of products from Streptomyces 2754
Liu Qi, Jiang Zhong-ke, Guo Lian-hong, Zhang Yang, Wu Jian-bo and Jiang Rong
Tab. 2 NMR data of 2754C in CD3OD
δH(mult, J(in Hz))b
1H-1H COSY
4.87(1H,q,J=7.2)
11
4.29(1H,m)
4,12
2.22(1H,dd,J=9.6,J=19.8) 3
2.72(1H,dd,J=3,J=19.8)
7.18(1H,d,J=7.2)
VEGFR-2(KDR/Flk-1)为靶位构建的酶抑制剂筛选模 型中初筛得到的阳性菌株[6]。从C2754发酵液中提取 分离得到2个黄色脂溶性组分，经提取、分离和结构 鉴别等工作，2754B确定为nanaomycin αA，2754C确 定为nanaomycin αA[7]。 1 实验材料 1.1 菌种
Key words VEGFR; C2754; Isolation; Purification; Structure determination
血管内皮生长因子受体(VEGFR)属受体酪氨酸 激酶(RTK)家族成员，其中VEGFR-2(KDR/Flk-1)是 内皮细胞VEGF信号传导的主要执行者，许多肿瘤的 发生发展都与VEGFR胞内酪氨酸激酶的异常表达密 切相关[1-2]。因此，VEGFR酪氨酸激酶的抑制剂有可 能成为治疗肿瘤的有效药物。目前已有两种酪氨酸 酶受体抑制剂药物上市，还有多种药物进入临床研 究[3]。而以KDR为靶点进行药物设计筛选成为抗肿瘤 血管生成的重要方略[4-5]。本文报道的C2754是从以
中国抗生素杂志2011年6月第36卷第6期
δcª 68.36 64.87
28.72
143.79 184.23 133.33 125.1 137.42 119.81 162.6 116.06 189.91. 147.17 19.66 41.21
172.97 32.19
表2 2754C的氢谱和碳谱数据
13C-NMR、1H-1H COSY、HMBC的各峰归属见表2。
结合DEPT，HSQC谱综合解析确定为已知化合物
nanaomycin αA。结构式见图2。
2.4 活性测定
2.4.1 VEGFR-2的抑制活性
活性测定采用酶联免疫吸附测定法(ELISA法)。
. 414 .
Position 1 3 4 4a 5 5a 6 7 8 9 9a 10 10a 11 12
cª
H(mult, J(in Hz))b
66.94
5.03(1H, q, J=7.2)
3
66.08
4.11(1H, m)
2.36(1H,dd, J=1.8, J=19.2)
4
28.40
2.75(1H,dd, J=3, J=19.2)
4a
142.64
5
183.11
5a
131.75
6
124.46
7.25(1H, d, J=7.2)
链霉菌2754发酵产物的分离提取及结构鉴定 刘祺等
1.2 培养基 斜面培养基(%) ：葡萄糖 0.5，酵母粉 0.5，牛肉
膏 0.5，胰蛋白胨 0.5，玉米浆 0.4，黄豆饼粉 1.0， CaCO3 0.4，琼脂 2。
种子培养基与发酵培养基(%)：葡萄糖 0.5，酵 母粉 0.5，牛肉膏 0.5，胰蛋白胨 0.5，玉米浆 0.4， 黄豆饼粉 1.0，CaCO3 0.4，pH7.2。 1.3 实验试剂
图3 2754B和2754C对 VEGF-R2/KDR的抑制率 Fig. 3 Inhibition of VEGFR-2/KDR by 2754B and 2754C
活性测定采用2倍稀释法。 由表4可知2754B与2754C对卡介苗和结核分枝 杆菌H37Rv具有较强抑菌活性。 3 讨论 根据已知文献记载七尾霉素类化合物具有抗真 菌，抗衣原体活性，同时还具有一定抗革兰阳性 菌，抗疟疾活性未见有抗结核活性报道[7,9]。本文通 过KDR酪氨酸激酶抑制剂筛选模型首次发现化合物
X-5大孔吸附树脂 葡聚糖凝胶LH20 (上海生化 试剂厂进口，分装) 所用试剂均为色谱纯。 1.4 实验仪器
紫外光谱仪：Shimadzu UV 2550；红外光谱 仪：美国热电公司(Thermo)傅里叶变换红外光谱图 仪nicolet5700核磁共振仪：日本电子制GSX24000 型；质谱仪：BIFLE X Bruker Inc；高效液相色谱仪: Agilent 1200A；高效液相色谱柱: 柱型号为Inertsil ODS22(416mm×150mm，5Lm)；中压液相色谱 仪：FMI-C(YAMA ZEN CORP)；中压液相色谱柱： ODS-A 120-S 30/50m 10mm×500mm。旋转蒸发仪 (BüCHI 2011, 瑞士)。 2 方法与结果 2.1 C2754的发酵
7
7.59(1H,t,J=7.2)
6,8
7.52(1H,d,J=7.2)
7
1.49(3H,d,J=7.2)
1
2.53(1H,dd,J=4.2,J=15.6)
3
2.66(1H,dd,J=8.4,J=15.6)
3
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4a,10a,12 1,4 4 7
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8
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1
O2
7
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5a
5 4a 4
3
12 13
OH
O
图1 2754B的结构
Fig. 1 Structure of 2754B
2.3.2 2754C
2754C为黄色无定形粉末，易溶于甲醇，乙
睛，二甲基亚砜，不溶于水。对酸，弱碱稳定，
热稳定性好。ESI-MS[M+H]+(m/z)：317.1；ESI-
将生长于新鲜斜面的C2754菌种接种于种子培养 基摇瓶中，28℃旋转振荡48h。以5%接种量转种于 发酵培养基(500mL)摇瓶中，于28℃往复振荡96h， 菌丝生长良好且呈棕色时收获。
2.2 提取分离 将C2754发酵液过滤, 滤液调pH至7.0，通过X5
型大孔吸附树脂，弃去流出液，分别用无盐水、
1,4,11 1,10a 4,13 4,13
14
OH O 11CH3
8
9
9a
10a 10
1
2 O
O
7
6
5a 5 4a 4 O
3
12 13 O1C4H3
图2 2754C的结构
Fig. 2 Structure of 2754C
抑制率按如下方法计算： 抑制率=(A450对照-A450样品) /A450对照×100%。 由图3可知2754B与2754C 对VEGFR-2有较强酶 抑制活性。 2.4.2 抗菌活性测定 活性测定采用2倍稀释法。由表3可知2754B与 2754C对抗甲氧菌金色葡萄球菌(MRSA)和金色葡萄 球菌(SA)有一定抑菌活性，对枯草杆菌(BS)和铜绿 假单胞菌(PA)活性较弱或无活性。 2.4.3 抗结核活性测定
. 412 .
中国抗生素杂志2011年6月第36卷第6期 文章编号：1001-8689(2011)06-0412-04
链霉菌2754发酵产物的分离提取及结构鉴定
刘祺 蒋忠科 郭连宏 张洋 吴剑波 姜蓉*
(中国医学科学院&北京协和医学院 医药生物技术所，北京 100050)
摘要：目的 从链霉菌2754中提取分离和纯化小分子VEGF受体抑制剂，并进行结构鉴定。方法 以酪氨酸酶活性测定方 法(ELISA法)为活性跟踪方法，利用大孔吸附树脂反相HPLC等方法进行分离纯化。利用光谱分析，进行结构解析。结果 分离 纯化到两个七尾霉素类化合物nanaomycin αA和nanaomycin αA并具有相关活性。结论 Nanaomycin αA和nanaomycin αA为已知 化合物，首次报道该化合物具VEGFR拮抗活性。
3256，2967，2932，1642，1616，1461，1287，
. 413 .
1268，1059，1016，759。 2754B的1HNMR和13C-NMR各峰归属见表1，与
相关文献对比其为nanaomycin A[8]，结构式见图1。
Position 1
表1 2754B的氢谱和碳谱数据
Tab.1 NMR data of 2754B in CDCl3
C2754菌株由中国医学科学院医药生物技术研究 所菌种中心提供。
收稿日期：2011-03-01 基金项目：本研究获得2009年中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金和科技部十一五“重大新药创制”科技重大专项-综合性新 药研究开发技术大平台(2009zx09301)资助。 作者简介：刘祺，男，生于1984年，在读硕士研究生。*通讯作者，E-mail：jr5602@yahoo.com.cn
睛，二甲基亚砜，不溶于水。对酸，弱碱稳定，
热稳定性好。ESI-MS [M+H]+(m/z)：289.3；ESI-
MS[M+Na]+ (m/z)：311.3，确定分子量288，分子
式C16H16O5。紫外吸收峰: λMeOHnm(logε)207，246，
272，420。红外光谱IR
v max
(KBr)cm-1：3327，
(Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences &Peking Union Medical college, Beijing 10050)
Abstract Objective To isolate, purify and determine the structure of inhibitors of VEGFR. Methods We use the ELISA method to find compounds, and Macroporous Resin, RP-PCR to isolate and purify compounds. The structure was determined by spectral analysis. Results Obtained two nanaomycin analogues: nanaomycinαA and nanaomycin βA, both of them have bioactivities. Conclusions NanaomycinαA and nanaomycin βA are known compounds . It is firstly reported about its antagonistic activity of VEGFR.
7
136.27
7.62(1H, d, J=7.2)
8
119.17
7.59(1H, d, J=7.2)
9
161.56
9a
114.75
10
188.46
10a
146.15
11
19.72
1.59(3H, d, J=7.2)
12
37.54
1.92(2H, m)
13
60.58
3.87(2H, m)
OH O 11CH3
30%丙酮、50%丙酮和80%丙酮洗脱。取80%丙酮
洗脱液，浓缩上HL-20凝胶柱，用100%甲醇洗脱，
分段收集流出液并于HPLC检测(流动相条件：水:乙
腈=50:50，流速：0.5mL/min)，分别在tR=16min和 tR=24min时有两个黄色组分。 2.3 性质及结构鉴定
2.3.1 2754B 2754B为黄色无定形粉末，易溶于甲醇，乙
MS[M+Na]+(m/z)：339.1，确定分子量316，分子式
C
17H
16O
。
6
紫外吸收
峰
:
λ n MeOH m
(logε)207，247，
272，420。红外光谱 IRvmax(KBr)cm-1：3081，2987，
1729，1643，1616，1458，Fra Baidu bibliotek366，1296，1270，
1248，1108，1075，847，752。2754C的1HNMR、
2754B 2754C 阳性对照
表3 2754B和2754C的抗菌活性 Tab. 3 Antibacterial activity of 2754B and 2754C
MRSA/(μg/mL)
关键词：VEGFR；C2754；分离纯化；结构鉴定 中图分类号：R979.1 文献标识码：A
Isolation, purification and structure identification of products from Streptomyces 2754
Liu Qi, Jiang Zhong-ke, Guo Lian-hong, Zhang Yang, Wu Jian-bo and Jiang Rong
Tab. 2 NMR data of 2754C in CD3OD
δH(mult, J(in Hz))b
1H-1H COSY
4.87(1H,q,J=7.2)
11
4.29(1H,m)
4,12
2.22(1H,dd,J=9.6,J=19.8) 3
2.72(1H,dd,J=3,J=19.8)
7.18(1H,d,J=7.2)
VEGFR-2(KDR/Flk-1)为靶位构建的酶抑制剂筛选模 型中初筛得到的阳性菌株[6]。从C2754发酵液中提取 分离得到2个黄色脂溶性组分，经提取、分离和结构 鉴别等工作，2754B确定为nanaomycin αA，2754C确 定为nanaomycin αA[7]。 1 实验材料 1.1 菌种
Key words VEGFR; C2754; Isolation; Purification; Structure determination
血管内皮生长因子受体(VEGFR)属受体酪氨酸 激酶(RTK)家族成员，其中VEGFR-2(KDR/Flk-1)是 内皮细胞VEGF信号传导的主要执行者，许多肿瘤的 发生发展都与VEGFR胞内酪氨酸激酶的异常表达密 切相关[1-2]。因此，VEGFR酪氨酸激酶的抑制剂有可 能成为治疗肿瘤的有效药物。目前已有两种酪氨酸 酶受体抑制剂药物上市，还有多种药物进入临床研 究[3]。而以KDR为靶点进行药物设计筛选成为抗肿瘤 血管生成的重要方略[4-5]。本文报道的C2754是从以