电转化方案

一、酵母菌电转化方案:
方案一。

1、负80度取出涂平板。

30度培养二天。

2、取平板单菌落接种到10ml YPD培养基的50ml的三角瓶中30度过夜摇培
3、4度3000~4000rpm半分钟离心收获细胞。

4、用20ml TE/LioAC(0.1M/0.1M pH7.5)重悬细胞，并在30度摇床摇培45分钟
5、加0。

5ml 1M DTT 再摇15分钟
6、加20ml双蒸水4度3500rpm离心半分钟
第一次沉淀用30ml冰冷的无菌水重悬
第二次沉淀用20ml冰冷的1M 的山梨醇重悬
第三次沉淀用1ml冰冷的1M 的山梨醇重悬
8、每40ul一个转化体系分装
9、转化条件1。

5KV 20uF 200Ω 40ul yeast /reaction 100ng DNA/reaction<5ul
10、加150ul 1M山梨醇快速混合酵母和DNA，然后涂在选择培养基上。

方案二、
1、负80度取出涂平板。

30度培养二天。

2、取平板单菌落接种到10ml YPSD（加SORBITOL）培养基的50ml的三角瓶中30度过夜摇培
3、4度3000~4000rpm半分钟离心收获细胞。

4、加20ml双蒸水4度3500rpm离心半分钟
5、第一次沉淀用30ml冰冷的无菌水重悬
第二次沉淀用20ml冰冷的1M 的山梨醇重悬
第三次沉淀用1ml冰冷的1M 的山梨醇重悬
6、每40ul一个转化体系分装
7、转化条件1。

5KV 20uF 200Ω 40ul yeast /reaction 100ng DNA/reaction<5ul
8、加1000ul 1M山梨醇快速混合酵母和DNA，
9、30度温浴1~2小时，不能摇动。

然后涂在选择培养基上。

二、怎么样选择电转仪（电转仪的功能与适用对象）
美国著名BTX是专业的细胞融合、电穿孔仪的生产厂家。

自从1983年起，苛求的科研工作者就已经把BTX产品作为电融合、转基因等应用领域的首选仪器。

除了占世界领导地位的电融合、转基因系统外，BTX的产品还包括多达25种相关的配件，其中有多种专业的电极，给用户更多的选择。

BTX还在网站建立了技术数据库，提供超过5000份的参考目录和600多份的protocols供科研工作者免费查阅。

1、ECM399转基因仪主要用于哺乳动物转染、细菌酶转化，具有脉冲长、磁场强为其特点。

应用举例
高压型用于：DNA或诱变等大肠杆菌结构转基因
低压型用于转染、淋巴、髓胶质成纤维和COS-7细胞
无论任何一种哺乳动物细胞均可选择不同的电压和脉冲范围，并且脉冲可随时调整
•细菌/酵母转化（系统：ECM399/630）
电穿孔现在被认作是转化细菌及酵母的最有效的方法。

革兰氏阴性细菌（例如大肠杆菌）一般比革兰氏阳性细菌更容易转化，因为他们的细胞壁组成不同。

对于革兰氏阴性细菌常常可以获得10的10次方转化2/微克DNA的转化效率，而对于革兰氏阳性细菌，一般可以得到10的6次方转化2/微克DNA。

Chang等人（1997）成功对一个mtz-敏感的Heliobacter pylori菌株进行电穿孔以传递mtz抵抗性。

Planelles等人（1999）使用电穿孔转化大肠杆菌，以避免使用包装物质。

最近电穿孔仪器方面的进展将使研究人员能够进一步优化细菌转化（例如脉冲长度产生方面扩展的功能条件）。

RNA、DNA、蛋白质以及小分子都已经通过电穿孔的方法转入酵母。

没有必要在电穿孔前部分去除酵母细胞壁，因为在完整酵母电穿孔方面的进展可以产生高的转化率。

Faber等人（1994）年优化了S.Cerevisiae的实验方案，使用Hansenula Polymorpha获得了比以前的报告增加300倍的转化效率。

在质粒修复中，质粒从酵母转入大肠杆菌以进行详细的DNA序列分析，这是另外一种重要的技术。

这种两个步骤的过程被电穿孔进行了简化，用于验证隐性基
因的结构，将其导入酵母，看基因性和表现性之间的关系。

已经建立了标准的实验方案使用指数衰减波发生器例如BTX ECM630转化细菌/酵母。

使用方形波电穿孔仪的实验方案，例如BTX ECM830，来转化细菌/酵母。

研究人员还成功将大的质粒（BAC及YAC）导入细菌。

电穿孔杯是细胞及酵母电穿孔的最常用附件，而Model747共轴电极使用则变得越来越普遍。

2、ECM630型是多才多艺型细胞转基因仪，适应于各类细胞
应用举例：
10-500V电压：适用于哺乳动物细胞，植物细胞
50-2500V电压：适用于细菌、酵母各种型号，均有多种脉冲选择
•细菌/酵母转化（系统：ECM399/630）
电穿孔现在被认作是转化细菌及酵母的最有效的方法。

革兰氏阴性细菌（例如大肠杆菌）一般比革兰氏阳性细菌更容易转化，因为他们的细胞壁组成不同。

对于革兰氏阴性细菌常常可以获得10的10次方转化2/微克DNA的转化效率，而对于革兰氏阳性细菌，一般可以得到10的6次方转化2/微克DNA。

Chang等人（1997）成功对一个mtz-敏感的Heliobacter pylori菌株进行电穿孔以传递mtz抵抗性。

Planelles等人（1999）使用电穿孔转化大肠杆菌，以避免使用包装物质。

最近电穿孔仪器方面的进展将使研究人员能够进一步优化细菌转化（例如脉冲长度产生方面扩展的功能条件）。

RNA、DNA、蛋白质以及小分子都已经通过电穿孔的方法转入酵母。

没有必要在电穿孔前部分去除酵母细胞壁，因为在完整酵母电穿孔方面的进展可以产生高的转化率。

Faber等人（1994）年优化了S.Cerevisiae的实验方案，使用Hansenula Polymorpha获得了比以前的报告增加300倍的转化效率。

在质粒修复中，质粒从酵母转入大肠杆菌以进行详细的DNA序列分析，这是另外一种重要的技术。

这种两个步骤的过程被电穿孔进行了简化，用于验证隐性基因的结构，将其导入酵母，看基因性和表现性之间的关系。

已经建立了标准的实验方案使用指数衰减波发生器例如BTX ECM630转化细菌/酵母。

使用方形波电穿孔仪的实验方案，例如BTX ECM830，来转化细菌/酵母。

研究人员还成功将大的质粒（BAC及YAC）导入细菌。

电穿孔杯是细胞及酵母电穿孔的最常用附件，而Model747共轴电极使用则变得越来越普遍。

•动物细胞转染（系统：ECM630/830）
对真核细胞的转染可以通过多种方法获得，例如磷酸钙沉淀、脂质体转染、病毒方法以及电穿孔。

电穿孔已经被正式对传统的转染方法不灵的细胞有很好的效果，因此被选为最佳的分子传递系统。

电穿孔的好处有可重复性、更高的效率、大量样本处理、无毒性以及容易使用（不需要孵育时间）。

Lofin等人（1999）对NIH/3T3细胞进行电穿孔使mRNA进入，以研究细胞周期及细胞分化过程中mRNA对基因表达调节、控制。

Bodwell等人（1999）在对COS-7细胞进行电穿孔是使用较长的脉冲时间后获得了较高水平的表达。

Warner 等人（1997）使用电穿孔方法成功转化了淋巴细胞。

Incyte Genomics公司成功使用BTX电穿孔仪转染了ES细胞进行转基因小鼠的生产。

BTX ECM399\630\830型仪器、电穿孔杯以及多种特用的电极都用于动物细胞转染用途。

•蛋白质电整合/电插入（系统：ECM630/830）
将蛋白质导入细胞以及将蛋白质插入至细胞膜中也可以通过电穿孔来实现。

不光肽段，而且包括抗体的多种蛋白，也可以进行导入。

Ushio-Fukai等人（1998）对电穿孔插入哺乳动物细胞中的外源蛋白进行了定量。

对于这些用途可以使用多种BTX电极。

•植物细胞转化（系统：ECM630/830）
对植物原生质（玉米、烟草等）及完整植物的电穿孔可以用于产生对农业/园艺有用的转基因作物。

植物细胞转化的一个主要目的是对植物细胞进行稳定转化以产生具有优良品质及产量增加的作物。

Lin等人（1997）优化了多种植物上用于GUS表达的电穿孔条件，结果显示完整植物细胞以及原生质都可以进行有效转化。

Diaz等人（1994）针对小麦及燕麦的叶和根的原生质进行了相似的优化试验，证明了电穿孔对于植物工作的有效性。

这些作者也比较了电穿孔与PEG的差别，结果发现电穿孔更有效、更有重复性、更经济。

BTX是世界上体内转染用特殊电极的领先者。

对于这些用途可以使用多种BTX电极，例如2针阵列、游标尺电极、以及Tweezertrodes。

•贴壁细胞的转染----ACT （系统：ECM630/830）
除了对盛在普通样品杯的悬浮细胞进行电穿孔外，还可以对多种培养板上的贴壁细胞进行原位电穿孔。

这样可以避免用胰酶消化细胞，有助于保持细胞的活性及
细胞数目。

Lewis等人（1999）使用培养皿电极将基因转染入人类及静脉内皮细胞。

Paptis等人（1998）通过对长在导电载玻片的NIH/3T3细胞进行原位电穿孔研究信号转导。

Teruel等人（1999）也对位于载玻片上的海马神经细胞转入DNA、RNA以及多种大分子。

BTX为贴壁细胞的转染（ACT）提供了PP35-2、366、747、840及Epizap电极系统。

请关注不久后为这些用途开发的新产品
•高通量筛检----HTS （系统：ECM630/830）
高通量筛检及cDNA文库的建立，需要一次处理多个样本的能力。

使用传统样品杯花费很大而且有时间限制。

然而，96孔板里使用的电极对于这些类型的应用肯定有用。

Hoffma-Tsay等人（1994）使用96孔共轴电极在植物融合实验中检测8种化学物质。

Peterfy等人（1995）比较了多种类型的多孔电极，将DNA传递入COS-7细胞。

Marrero等人（1997）使用多孔电极将抗体电导入血管平滑肌细胞，以诱导细胞增值。

BTX目前提供747和840用于这样的用途，并且不断开发新的产品。

•大容量生产（LVP）及先体外后体内基因治疗（系统：ECM600F）
工业用大容量生产或者先体外后体内基因治疗也为社会所需。

人们可以先在样品杯里优化条件然后将实验方案转成流水线作业，将实验进行比例放大。

BTX ElectroFlowPorator系统有一个泵及一个改进了的电穿孔仪组成。

泵可以进行编程并与电穿孔仪进行同步操作，以将脉冲传递多批的细胞。

Parham等人(1999)使用流动性系统优化了CHO、COS-7、HEK293、NSO、CV-1细胞的短暂基因表达，，获得了满意的结果。

技术规格工作状况：
具有开机自检功能
接口：数字式用户接口
输入电压：110V/220V AC
充电时间：最长5秒
电压范围：10-500V低压工作模式/每次1V调进
50-2500V高压工作模式/每次调进5V
电容：1μF，25μF-3275μF低压工作模式每次25μF调进25μF，50μF高压工作
模式
电阻：25-1575W调进/每次25W调进（高压工作模式）
脉冲：低压工作模式>8300RC时间常数
高压工作模式>126RC时间常数
安全：抗短路保护最长延迟10秒
其它指标：电流量：低压工作模式限6000A
高压工作模式限3000A
物理参数：尺寸：12.5"×12.25" ×5.5"(W×D×H)
重量：10磅（4.5公斤）
显示：20×4位LCD液晶显示屏
控制器：旋转式电压选择钮按压式电源开关及乒乓式触发开关
监测：能监测电压峰值Vp及RC充放电时间常数
3、ECM 830系列产品在转基因的应用领域中得以广泛的应用，其无以伦比的高性能得到了全球同行的厚爱。

BTX的系列产品适用于动植物、细菌、酵母、哺乳动物、人类细胞（包括动物活体）的转基因等操作，
体内基因导入（IVGD）（系统：ECM830）
在动物活体内基因转移的非病毒技术中，直接将质粒DNA注射进入肌肉内是简单、廉价及安全的。

Aihara及Miyazaki（1998）第一次指出通过在肌肉内将DNA 注射与电穿孔相结合，可以将表达增强100倍。

Mir等人（1999）使用多种类型的电极将基因传递进入多种种属的骨骼肌（大鼠、小鼠、兔、猴）。

他们的结果显示通过使用电穿孔以及DNA注射：（1）基因转移的效率大大增加了，只是表达增强2-4倍；（2）不同实验之间的差别缩小了，而这正是单独DNA注射的主要缺点；（3）表达持续时间很长（数月），这对于长期临床应用非常重要；（4）不同种属的不同的肌肉都有阳性的反应，说明广泛的可用性；（5）基因表达非常特异仅在局部，而周围组织则没有影响到。

这种技术成功用于其他组织，例如肝、睾丸、以及皮肤。

最近Vicat等人（1999）通过体内电穿孔仪将基因传递如小鼠脑组织。

与被称为有力的脑组织基因转移的非病毒载体的pCMV-luc与PolyEthylenlmine联合的方
法相比，电穿孔的效率要高50倍。

Nishi等人证明使用电穿孔可以获得有效的神经胶质瘤基因转移。

Nishi还显示对实体瘤进行电基因治疗后肿瘤生长阻滞了50-90%。

Dean等人将基因电导入完整的肠系膜动脉获得了成功。

电穿孔已经被证实确实是进行体基因/药物转移方面一项有前途的技术，有许多新奇的用途。

BTX公司特制的2针阵列电极、Genetrodes、卡钳电极、Tweezertrodes提供将基因侵入性以及侵入性转移入组织的方法。

卵内基因转移（IOGD）（系统：ECM830）
Muramatsu等人（1997）比较了3种转染方法用于将外源基因转入早期鸡胚进行表达。

他发现与脂质体转染及基因枪相比，电穿孔是最有效的方法。

Takeuchi 等人（1999）使用电穿孔技术将早期鸡胚转染了tbx5及tbx4基因，以确定肢芽的翅/腿标志。

对于这种用途已经开发出特用的电极。

Genetrodes、L形状针电极，被用于测定鸡胚及靶向组织的特定区域。

许多研究人员已经转染了眼、心或者肢体组织，方便了发育生物学方法的进一步研究。

刚上市的足控开关具有遥控功能，是ECM830可以在不需要手操作的情况下进行激活，这对于卵内、体内以及体外胚胎用途非常重要。

体外胚胎基因转移（IVEGD）（系统：ECM830）
Tasaki等人（1999）讨论了使用电穿孔在体外小鼠胚胎方面的运用。

小鼠胚胎有柱状的结构而且有比家禽更多胚胎培养基操作需求。

有可能对胚胎进行电穿孔用于异位表达研究。

在小鼠中后脑部的基因表达已经被观察。

这个技术也用在交配后9.5天小鼠胚胎，以研究Hu基因在神经分化中的功能。

BTX为这些目的提供一种全新的电极：Genepaddles。

技术规格
工作状况：具有开机自检功能
接口：数字式用户接口
输入电压：110V AC/220Hz
充电时间：最长5秒（无延时）
电压范围：5-500V低压工作模式连续可调/每次1V调进
20-3000V高压工作模式/每次5V调进
脉宽选择：10μs-999μs低压工作模式/1μs精度
1ms-999ms高压工作模式/1ms精度
1s-10s低压工作模式/0.1s精度
10μs-600μs高压工作模式/1μs精度
脉冲个数：1-99
脉冲间隔：100ms-10s
安全性：抗短路保护设计
其它指标：电容量：4000μF
电流量：10μs 500A
物理参数：尺寸：12.5"×12.25" ×5.5"(W×D×H)
重量：15磅（6.8公斤）
显示：20×4位LCD液晶显示屏
控制器：旋转式电压选择钮
按压式电源开关及乒乓式触发开关
串连接口：RS232和RS485
监测：能监测显示电压(V)时间(t)脉冲数(n)
4、ECM2001是一台万能的细胞操作仪器，它综合了电穿孔仪和电融合仪的特点，
ECM2001在细胞融合时，分三个阶段，预融合、融合、后融合阶段
ECM2001在预融合时可产生一种独特的高频交流波，交流波将细胞排列成双体或株琏，以便融合的进行，提高了融合的效率。

融合阶段：交流波和直流波的转换之间设有微秒开关，能在极短时间内从交流电转成直流电。

在方波长电波的作用下，使细胞高效融合，
融合完成后，ECM2001立即产生了低电压的交流波可使已初步融合的细胞更完美的聚集在一起，完成细胞圆体程序。

当转基因向导流需要较高的电压和较长的脉冲时，直流方波长脉冲可单独使用，完成转基因。

应用举例
•胚胎操作/核移植/动物克隆（系统：ECM2001/830）
核移植是将细胞核从供体转入受体的过程。

细胞核指导胚胎的发育，导致新生体安全出生。

在这个过程中，电融合用于将供体细胞与受体卵细胞融合，并进一步激活细胞分裂，形成胚胎。

Meng等人（1997）将核移植技术扩展至灵长类动物模型，克隆出恒河猴。

技术的进步使研究人员能够从分裂球进展至更高分化的胚胎细胞以及静止的胚儿细胞，作为核的供应来源。

胚胎产生的细胞在体外培养6-13代，然后在转入前使用血清饥饿的方法使细胞静止。

如前文所述，Roble、Cibelli以及Stice是第一次在1998年报告使用非老化胚成纤维细胞作为核的供体进行核移植而产生绵羊克隆转基因牛的人。

Ian Wilmut在1996年震惊了整个世界，他从成年乳腺的细胞产生出第一个动物克隆——多利。

使用分化的成年细胞进行克隆的能力打开了核移植广泛运用的大门即基因治疗的令人激动的模式。

最近的成功事例PPL Therapeutics公司从成年体细胞克隆出猪。

对于这些用途可以使用多种细胞融合样品池及微型载玻片。

•动物细胞融合（系统：ECM2001）
肿瘤及树突的电融合目前在过继性免疫疗法中进行使用。

肿瘤细胞本身不能作为良好的抗原提成细胞，因此不会刺激T细胞生长。

树突细胞是已经发现的最好的抗原提呈细胞，在融合后可以将肿瘤细胞转变成抗原提呈细胞。

刺激后比未融合肿瘤细胞至少增加100倍。

对于这些用途可以使用多种细胞融合附件及微型载玻片。

•杂交瘤/细胞杂交瘤技术（系统：ECM2001）
在过去十年中，使用电融合技术进行杂交瘤的产生及抗体大大增加。

电融合的过程可以通过显微镜进行观察，与PEG相比需要的细胞数量较少。

使用电融合用于这种用途还有无毒性及高效性的优点。

Panova等人（1995）通过把人类B细胞与Heteromyeloma、Spam-8细胞进行电融合增强了人类杂交瘤的生成。

Kreutz等人（1998）引入了一种使用电融合及FACS分选的新方法产生细胞杂交瘤。

Cao等人（1995）建立了另一种快速非选择性方法通过电融合产生人类细胞杂交瘤。

数据明确支持电融合用于这种重要目的的有效性。

对于这些用途可以使用多种细胞融合附件及微型载玻片。

植物原生质的融合（系统：ECM2001）
电融合可被用于融合植物原生质以产生杂交体及创造具有所需特性的作物。

Hofmann-Tsay等人（1994）试验了可以的融合促进物质，发现一些多聚物可以便利融合过程而不影响细胞新生。

Chen等人（1995）将原生质从2种种属的Porphyria进行融合，成功率高达85%。

这些鼓舞人心的数据提示电融合与传统的PEG融合方法相比，可以改善融合效率以及可重复性。

对于这些用途可以使用多种细胞融合附件及微型载玻片。

5、BTX Electro Flow Porator T9000,与电穿孔系统一起使用，用于对大容量的细胞进行转化/转染。

T9000是市场上可购到的唯一一个大容量电穿孔系统
BTX Electro Flow Porator T9000,与电穿孔系统一起使用，用于对大容量的细胞进行转化/转染。

T9000是市场上可购到的唯一一个大容量电穿孔系统。

这个系统可以于指数衰减脉冲发生器一起使用。

Electro Flow Porator包括带I/O接口一个蠕动泵、一个安全座台、五个无菌镀金流通室箱及管道。

T9000可以用于在一个电穿孔杯中使用一个小的容量，再对电穿孔参数进行优化后对大容量的细胞进行电穿孔。

一旦确定理想的电场强度及脉冲长度，试验可以很容易地应用Electro Flow Porator进行比例放大。

蠕动泵可以按照电穿孔参数编程，设定流速和脉冲时间。