8DEAE-纤维素离子交换层析纯化血清白蛋白
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DEAE- cellulose (diethylaminoethyl cellulose)
离子交换剂的选择
考虑因素：
1.被分离物质带何种电荷 2.被分离物质分子的大小
大分子物质选用凝胶，其次选用纤维素 3.被分离物质所处的环境 4.被分离物质的物理化学性质 5.被分离物质的大概数量
•对于两性蛋白而言，结合力取决于其等电点以及溶 液的pH值。
综合实验（一） 血清蛋白质的纯化与鉴定
蛋白质的分离纯化
• 蛋白质的分离纯化是对蛋白质进行研究的一项必需的和基础 的工作。目前常使用的分离纯化的方法或技术都是在了解蛋 白质性质和结构特点的基础上建立的。
• 目标蛋白质的分离纯化程序主要包括 – ⑴材料的选择； – ⑵组织匀浆和破碎细胞获取粗提取液； – ⑶蛋白质初步提纯； – ⑷选择一种或几种合适的方法除去杂蛋白,直至完全纯化； – ⑸目标蛋白的鉴定。
化血清白蛋白 • 第二部分： （下周）
采用醋酸纤维素薄膜电泳鉴定纯化 得到的白蛋白
第一部分
• DEAE-纤维素离子交换层析（Ion Exchange Chromatography, IEC）纯化 血清白蛋白
本次实验目的
1、分离血清得到高纯度的白蛋白 2、掌握DEAE-纤维素离子交换层析原理与
实验操作技术 3、了解紫外检测仪、自动部分收集器、记
-H+
R—CH—COOH
|
+H+
NH3+
pH<pI
-H+
R—CH—COO-
|
+H+
NH3+
pH=pI
R—CH—COO-
|
NH2
pH>pI
A+ cation
A0 zwitterion
Aanion
起始缓冲液的选择
• 原则： – 不能与样品发生化学反应，避免使样 品变性。 – 其pH值和离子强度等能使样品中有效 成分与离子交换剂结合，而不能使样 品中杂质与离子交换剂结合。
6.5）
3、样品：血清
实验步骤
1. DEAE—纤维素层析柱的准备
（1）酸碱处理：DEAE-纤维素可按0.5mol/L NaOH → 0.5mol/L HCl →0.5mol/L NaOH（碱→酸→碱）程 序处理。
（2）装柱：选用短而粗的层析柱（1.6cm×20cm。将 经上述酸碱处理的纤维素用0.06mol/LNH4Ac缓冲 液（pH 6.5）浸泡后装柱，柱床体积约1.6cm×6cm。
• 用于研究目的蛋白质通常应保持它的生物活性 – 较低温度下(0－4℃)操作，注意使用蛋白酶(使蛋白质降解 的酶)的抑制剂，避免使用剧烈条件，以免蛋白质特定的折 叠结构受到破坏。
实验目的
• 分离血清得到高纯度的白蛋白 • 对纯化得到的白蛋白进行电泳鉴定
实验内容
• 第一部分： （本周） 采用DEAE-纤维素离子交换层析纯
• 2）穿流峰的洗脱：连接层析系统，继续用0.06mol/LNH4Ac 缓冲液（pH6.5）洗脱未吸附到层析柱上的蛋白，直到记录 仪基线基本恢复到原始位置。然后将柱中的缓冲液面降至与 柱床表面平齐。
• 3）白蛋白的纯化：改用0.3mol/LNH4Ac缓冲液（pH6.5）洗 脱。每管1ml分部收集 (调节部分收集器时间为1min/tube)。 合并蛋白质浓度高的2-3管，用于后续蛋白质纯度鉴定。
• 带正电荷蛋白质如γ-球蛋白（pI约7.3），不被吸附 故直接流出。用0.06mol/L醋酸铵缓冲液洗脱吸附在 离子交换柱上的少量β-球蛋白及α-球蛋白。
• 将醋酸铵浓度提高至0.3mol/L，白蛋白被洗脱下来 （尚混有少量α-球蛋白）。
• 整个层析过程用紫外检测仪监测流出蛋白组分，用wk.baidu.com自动部分收集器收集，用记录仪记录整个洗脱过程。
材料与试剂
1、主要材料
– pH计、层析柱（1.6×20cm）、固定架、聚乙烯 管（不同规格）、HD-3紫外检测仪、自动部分 收集器、记录仪、恒压高位槽等。
2、主要试剂
– 0.06mol/L NH4Ac缓冲液（pH 6.5） – 0.3mol/L NH4Ac缓冲液（pH 6.5） – 1.5mol/L NaCl—0.3mol/L NH4Ac缓冲液（pH
洗脱液
• 指一定离子强度与一定pH值的缓冲溶液 • 洗脱方法：
– 改变洗脱液的离子强度
增强洗脱液与离子交换剂的结合力
– 改变洗脱液的pH
降低待分离物与离子交换剂的结合力
• 洗脱方式：
– 阶段洗脱法 – 梯度洗脱法
人血浆蛋白质的等电点及分子量
蛋白质
清蛋白
α1-球蛋白 α2-球蛋白 β-球蛋白 γ-球蛋白
等电点 4.88 5.06 5.06 5.12
6.85-7.50
分子量 69000 200000 300000 9000-150000 156000-300000
• 0.06mol/L NH4Ac缓冲液（pH 6.5）
实验原理
• 采用DEAE-纤维素离子交换层析纯化血清白蛋白。
• 血清样品用0.06mol/L醋酸铵缓冲液（pH 6.5）稀释 5倍后上柱。在此pH与离子强度时，DEAE-纤维素 带有正电荷，能吸附带负电荷的蛋白质如白蛋白 （pI 4.9）。
录仪、恒压高位槽的原理与使用方法
离子交换层析（Ion Exchange Chromatography, IEC）的基本原
理
• 根据待分离物质带电性质不同的分离纯化方法。 • 以离子交换剂为固定相，特定的离子溶液为流
动相，依据各种离子或离子化合物与离子交换 剂的结合力不同进行分离纯化的层析方式。
离子交换剂
– 装柱时应注意装柱均匀，柱床内不得有界面、气泡，表 面要平整。
（3）平衡：装柱后接上恒压贮液瓶，用0.06mol/L NH4Ac （pH 6.5）洗涤平衡，流速 1ml/min。
2、DEAE—纤维素层析纯化白蛋白
• 1）上样：将4ml 用缓冲液稀释后的血清样品加入上述已平衡 好的层析柱表面，使样品进入柱床内。小心用4ml 0.06mol/L NH4Ac缓冲液洗涤沾在管壁上的蛋白质样品，使其进入床内。
离子交换剂由基质、电荷基团（或称功能基团） 和 反离子组成。基质一般是不溶性聚合物，如 纤维素，交联葡聚糖，交联琼脂糖等；
基质
电荷基团 反离子
纤维素－O — CH2— COO-— Na＋ 阳离子交换剂
树脂 －O — N+(CH3)2 — OH- 阴离子交换剂
离子交换剂
CM- cellulose (Carboxymethyl cellulose)
离子交换剂的选择
考虑因素：
1.被分离物质带何种电荷 2.被分离物质分子的大小
大分子物质选用凝胶，其次选用纤维素 3.被分离物质所处的环境 4.被分离物质的物理化学性质 5.被分离物质的大概数量
•对于两性蛋白而言，结合力取决于其等电点以及溶 液的pH值。
综合实验（一） 血清蛋白质的纯化与鉴定
蛋白质的分离纯化
• 蛋白质的分离纯化是对蛋白质进行研究的一项必需的和基础 的工作。目前常使用的分离纯化的方法或技术都是在了解蛋 白质性质和结构特点的基础上建立的。
• 目标蛋白质的分离纯化程序主要包括 – ⑴材料的选择； – ⑵组织匀浆和破碎细胞获取粗提取液； – ⑶蛋白质初步提纯； – ⑷选择一种或几种合适的方法除去杂蛋白,直至完全纯化； – ⑸目标蛋白的鉴定。
化血清白蛋白 • 第二部分： （下周）
采用醋酸纤维素薄膜电泳鉴定纯化 得到的白蛋白
第一部分
• DEAE-纤维素离子交换层析（Ion Exchange Chromatography, IEC）纯化 血清白蛋白
本次实验目的
1、分离血清得到高纯度的白蛋白 2、掌握DEAE-纤维素离子交换层析原理与
实验操作技术 3、了解紫外检测仪、自动部分收集器、记
-H+
R—CH—COOH
|
+H+
NH3+
pH<pI
-H+
R—CH—COO-
|
+H+
NH3+
pH=pI
R—CH—COO-
|
NH2
pH>pI
A+ cation
A0 zwitterion
Aanion
起始缓冲液的选择
• 原则： – 不能与样品发生化学反应，避免使样 品变性。 – 其pH值和离子强度等能使样品中有效 成分与离子交换剂结合，而不能使样 品中杂质与离子交换剂结合。
6.5）
3、样品：血清
实验步骤
1. DEAE—纤维素层析柱的准备
（1）酸碱处理：DEAE-纤维素可按0.5mol/L NaOH → 0.5mol/L HCl →0.5mol/L NaOH（碱→酸→碱）程 序处理。
（2）装柱：选用短而粗的层析柱（1.6cm×20cm。将 经上述酸碱处理的纤维素用0.06mol/LNH4Ac缓冲 液（pH 6.5）浸泡后装柱，柱床体积约1.6cm×6cm。
• 用于研究目的蛋白质通常应保持它的生物活性 – 较低温度下(0－4℃)操作，注意使用蛋白酶(使蛋白质降解 的酶)的抑制剂，避免使用剧烈条件，以免蛋白质特定的折 叠结构受到破坏。
实验目的
• 分离血清得到高纯度的白蛋白 • 对纯化得到的白蛋白进行电泳鉴定
实验内容
• 第一部分： （本周） 采用DEAE-纤维素离子交换层析纯
• 2）穿流峰的洗脱：连接层析系统，继续用0.06mol/LNH4Ac 缓冲液（pH6.5）洗脱未吸附到层析柱上的蛋白，直到记录 仪基线基本恢复到原始位置。然后将柱中的缓冲液面降至与 柱床表面平齐。
• 3）白蛋白的纯化：改用0.3mol/LNH4Ac缓冲液（pH6.5）洗 脱。每管1ml分部收集 (调节部分收集器时间为1min/tube)。 合并蛋白质浓度高的2-3管，用于后续蛋白质纯度鉴定。
• 带正电荷蛋白质如γ-球蛋白（pI约7.3），不被吸附 故直接流出。用0.06mol/L醋酸铵缓冲液洗脱吸附在 离子交换柱上的少量β-球蛋白及α-球蛋白。
• 将醋酸铵浓度提高至0.3mol/L，白蛋白被洗脱下来 （尚混有少量α-球蛋白）。
• 整个层析过程用紫外检测仪监测流出蛋白组分，用wk.baidu.com自动部分收集器收集，用记录仪记录整个洗脱过程。
材料与试剂
1、主要材料
– pH计、层析柱（1.6×20cm）、固定架、聚乙烯 管（不同规格）、HD-3紫外检测仪、自动部分 收集器、记录仪、恒压高位槽等。
2、主要试剂
– 0.06mol/L NH4Ac缓冲液（pH 6.5） – 0.3mol/L NH4Ac缓冲液（pH 6.5） – 1.5mol/L NaCl—0.3mol/L NH4Ac缓冲液（pH
洗脱液
• 指一定离子强度与一定pH值的缓冲溶液 • 洗脱方法：
– 改变洗脱液的离子强度
增强洗脱液与离子交换剂的结合力
– 改变洗脱液的pH
降低待分离物与离子交换剂的结合力
• 洗脱方式：
– 阶段洗脱法 – 梯度洗脱法
人血浆蛋白质的等电点及分子量
蛋白质
清蛋白
α1-球蛋白 α2-球蛋白 β-球蛋白 γ-球蛋白
等电点 4.88 5.06 5.06 5.12
6.85-7.50
分子量 69000 200000 300000 9000-150000 156000-300000
• 0.06mol/L NH4Ac缓冲液（pH 6.5）
实验原理
• 采用DEAE-纤维素离子交换层析纯化血清白蛋白。
• 血清样品用0.06mol/L醋酸铵缓冲液（pH 6.5）稀释 5倍后上柱。在此pH与离子强度时，DEAE-纤维素 带有正电荷，能吸附带负电荷的蛋白质如白蛋白 （pI 4.9）。
录仪、恒压高位槽的原理与使用方法
离子交换层析（Ion Exchange Chromatography, IEC）的基本原
理
• 根据待分离物质带电性质不同的分离纯化方法。 • 以离子交换剂为固定相，特定的离子溶液为流
动相，依据各种离子或离子化合物与离子交换 剂的结合力不同进行分离纯化的层析方式。
离子交换剂
– 装柱时应注意装柱均匀，柱床内不得有界面、气泡，表 面要平整。
（3）平衡：装柱后接上恒压贮液瓶，用0.06mol/L NH4Ac （pH 6.5）洗涤平衡，流速 1ml/min。
2、DEAE—纤维素层析纯化白蛋白
• 1）上样：将4ml 用缓冲液稀释后的血清样品加入上述已平衡 好的层析柱表面，使样品进入柱床内。小心用4ml 0.06mol/L NH4Ac缓冲液洗涤沾在管壁上的蛋白质样品，使其进入床内。
离子交换剂由基质、电荷基团（或称功能基团） 和 反离子组成。基质一般是不溶性聚合物，如 纤维素，交联葡聚糖，交联琼脂糖等；
基质
电荷基团 反离子
纤维素－O — CH2— COO-— Na＋ 阳离子交换剂
树脂 －O — N+(CH3)2 — OH- 阴离子交换剂
离子交换剂
CM- cellulose (Carboxymethyl cellulose)