宽场_共振能量转移全内反射荧光的显微技术及其应用_张少华

*[基金项目] 国家自然科学基金重点项目(30430270)

[作者单位] 1华中科技大学同济医学院病理生理学系,邮政编码

武汉430030;

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湖北省黄石理工学院医学院; 通讯作者:王建枝,

E -mail:W angjz@

本文2004-10-26收到,2005-01-20修回,2005-03-20接受宽场-共振能量转移-全内反射荧光的显微技术及其应用

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张少华1

曹福元1

胡茂琼2

综述 王建枝1

审校

[中图分类号] Q6-33 [文献标识码] A [文章编号] 1005-1740(2005)02-0067-03

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590年世界上第一台光学显微镜诞生,在随后的几百

年间,显微科学取得迅猛发展。人们逐渐地改进了成像质量,而且各种新的光学显微镜也应运而生。生命

科学中大量的事实表明细胞的动力学特征是起源于单个蛋白质分子的聚合和相互作用,对它的研究变得尤为重要。但是传统的光学显微镜由于受到光瞳远场衍射效应的影响,存在分辨极限[1]。光学显微镜空间分辨极限约250nm 。从应用的角度,传统的光学显微术无法满足更高的分辨率要求。还都需要破碎细胞或对细胞造成损伤,无法做到在活细胞生理条件下实时地对细胞内蛋白质-蛋白质间相互作用进行动态研究。而基于强度的影像技术例如荧光共振能量转移(FRET )方法(宽场,共聚焦,双光子),使得研究活细胞内的这些相互作用变得容易了[2]。使许多复杂的研究例如蛋白质功能和加工、基因表达和第二信使传递、胞内信号传导等研究成为可能。显微荧光成像技术可在溶液,细胞悬液,多细胞,单细胞,细胞膜,细胞器等不同层次提供示踪、定性、定量等研究,例如对生物大分子间的相互作用、距离、动力学特性等。本文就基于常规宽场荧光显微技术、荧光共振能量转移显微技术和全内反射荧光显微技术的荧光显微光学实验平台分别进行了介绍和对比评估。1 宽场荧光显微技术

1.1 宽场荧光(Wide F ield Fluorescence,WFF )显微原理

宽场荧光显微术,是整个目标被激发光曝光,贯穿整个样本(焦面和焦外)的发射光被高数值孔径(N A)物镜收集。是荧光显微技术中最简单和最广泛应用的荧光光学平台。1.2 WF F 显微的技术要求

激发光源,常见的有汞灯和氙灯,汞氙复合电弧灯。汞灯的光谱中有丰富的紫外成分,并在某些特定的波长激发能

量存在峰值,因此,可以配合特定的荧光染料得到非常好的信噪比。但也正是由于汞灯光谱特性不平坦,限制了其在定量测量方面的应用,而主要用于形态学观察。对于做定量动态测量的应用,一般选择光谱特性相对平坦的氙灯。在双波长测量Ca 2+,M n 2+等离子浓度的应用中,一般选择氙灯做激发光源。而汞氙复合电弧灯结合了汞灯和氙灯的优点,可以用于定性形态学观察和定量测量复合电弧灯。利用光栅或滤镜可以选择性地得到某个特定波长的激发光,激发光通过聚光器光路和显微镜物镜光路照射到样品平面,激发出样品中荧光生色团的荧光。

显微镜和荧光物镜,在荧光显微技术中,对显微镜透射光照明设备的要求并不高。但对于物镜,则要求很高,需要满足两个基本要求:1)物镜的激发光频段通透性尽可能要好,以便让足够多的激发光达到样本平面。2)物镜的数值孔径尽可能高,由于荧光非常微弱,高数值孔径的物镜可以提高收集效率

[3]

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检测设备,在宽场荧光显微技术中,一般使用科研级的电荷耦合器件(Charged Coupled Dev ice,CCD)(图像传感器)作为检测设备,要求低暗电流,高光电转换效率(Q E),低读出噪音,高分辨率。在特别弱的荧光检测应用,例如单分子荧光检测中,由于信号极其微弱,需要使用有EM (电子增益)的CCD,将信号在CCD 芯片内部先进行放大,提高信噪比,然后再由读出电路转换出去。这样可以获取极其微弱的荧光信号。在单分子动态成像(曝光时间短)应用中,可以获取有效的动力学信息[3]。1.3 WFF 显微技术的应用

宽场荧光显微技术,在形态学研究、定性鉴定、定量测量等方面都有广泛的应用。利用合适的荧光染料,例如Fura -2,Indo -2,可以研究细胞内钙信号的动力学特性。使用Fura -2染料时,选择双波长(340nm/380nm)激发,单波长(510nm)检测模式;而使用Indo -1染料时,则选择单波长(K )激发,双波长(K )检测模式。可以测量细胞内Ca 2+浓度信号的变化以及细胞间的Ca 2+浓度分布信号,例如与分泌的耦联、钙振荡等等。如果选择荧光蛋白作为荧光标记物,则可以实现宽场荧光共振能量转移(Wide F ield F RET )测量[4]。

微循环学杂志,2005,15(2):67~69

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C 2005 C HINES E JOUR NAL OF MIC ROC IR C ULA TION

2荧光共振能量转移显微技术

2.1荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Ener gy T ransfer,FRET)显微原理

FRET是一种非辐射能量跃迁,通过分子间的电偶极相互作用,将供体激发态能量转移到受体激发态的过程,使供体荧光强度降低,而受体可以发射更强的它自已的物征荧光(敏化荧光),也可以不发荧光(荧光淬灭),同时也伴随着它们寿命的相应缩短和延长。作为共振能量转移供、受体对,荧光物质必须满足以下条件:¹供、受体的激发光要分得足够开;º供体的发射光谱与受体的激发光谱要重叠;»供、受的发射光谱要足够分得开。能量转移的效率和供体的发射光谱与受体的吸收光谱的重叠程度、供体与受体的跃迁偶极的相对取向、供体与受体之间的距离等有关。发生FRET 时,分子间距离小于10nm。如果发生F RET,则供体通路信号将淬灭而受体通路信号将激活或增强[5]。FR ET显微技术高度依赖如何快速高效地捕获来自标定分子间相互作用的短暂微弱的荧光信号的能力。由于能量传递发生在1~ 10nm,一个F RET信号代表了一个显微镜图象中的一个特殊位置。这等效于提供了一个额外的放大倍数,使FRET超越显微镜的分辨率限制而以分子尺度分辨出供体-受体的平均距离,并能显示出受体-供体的相互作用。

2.2FRET显微技术形成

荧光共振能量转移是指两个荧光发色基团在足够靠近时,当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态,在该电子回到基态前,通过偶极子相互作用,实现能量向邻近的受体分子转移(即发生能量共振转移)。

2.3FRET显微技术应用

以绿色荧光蛋白分子(GF P)的两个突变体的青色荧光蛋白分子(CFP)和黄色荧光蛋白分子(YFP)为例,CF P的发射光谱与YF P的吸收光谱有相当的重叠,当它们足够接近时,用CFP的吸收波长激发,CF P的发色基团将会把能量高效率地共振转移至YF P的发色基团上,所以CFP的发射荧光将减弱或消失,主要发射将是YFP的荧光。两个发色基团之间的能量转换效率与它们之间的空间距离的6次方成反比,对空间位置的改变非常灵敏。如果将CFP/YF P 分别标定在要研究的两种蛋白质a和b上。当蛋白质a与b 没有发生相互作用时,CF P与Y FP相距很远不能发生F RET,因而检测到的是发射波长476nm的CFP荧光;但当蛋白质a与b发生相互作用时,由于蛋白质b受蛋白质a作用而发生构象变化,使CF P与Y FP充分靠近发生荧光F RET,此时检测到的就是发射波长为527nm的YF P荧光[2]。人们已经利用生物体自身的荧光或者将有机荧光染料标记到所研究的对象上,成功地应用于核酸检测,蛋白质结构、功能分析,免疫分析,细胞器结构功能检测等诸多方面[6]。

3全内反射荧光显微技术

3.1全内反射荧光显微技术(T otal Inter ior Reflect ion Fluo-rescent,T I RF)显微原理

T I RF是一种特殊的宽场荧光显微技术。当光从光密物质向光疏物质照射,当入射角达到或超过某个临界角度时,将发生全反射,将绝大部分能量反射回光密物质,而小部分能量在交界面上将产生一个隐失场(Ev anescent Field),能量集中在厚度从几十至几百nm之间的范围内,且在垂直方向呈指数衰减[5]。发生全内反射时,在低折射率介质中隐失场的典型渗透深度一般在100nm量级。如果样品紧贴界面放置,则隐失场对样品的垂直照射深度也为~100nm(其它光学成像方法的照射深度比这大得多,以共焦显微技术为例,照射深度~500到800nm)。只有这个极其薄的层面中的荧光分子将被激发,而在这个范围外的整个背景的其他任何深度的荧光基团都不会被激发。所以T IRF显微术具有其它成像方法无法比拟的高的信噪比。细胞的光损伤和光漂白也很小[1,7]。

3.2T IRF技术组成

构造全内反射荧光显微成像系统,主要有棱镜型和物镜型两种[1]。棱镜型系统在实现上更加容易,它只需要激光光源、棱镜和显微镜。在探测上,它也不容易受到入射光信号的干扰,但是放置样品的空间受到棱镜的限制,而且出射到斜上方的激光光束对实验人员的构成一定的辐射威胁。而在物镜型全内反射显微系统中,显微镜的物镜既接收样品荧光信号,同时又作为发生全内反射的关键聚焦光学器件。由于细胞的典型折射率为1.33~1.38,因此要想实现全内反射,物镜的NA必须大于1.38。如果使用为1.4的透镜物镜时,只有很小的一部分物镜孔径范围(1.4-1.38=0.02)可以被利用,这显然增加了光束校准的难度,同时光束的强度也很难提高。如果使用NA1.65的透镜物镜,则有一个大得多的孔径范围(1.65-1.38=0.27)可被利用,即有更多的激发光强可以用来产生全反射[3]。

3.3T IRF显微技术应用

细胞内的很多至关重要的生命活动过程均存在于细胞表面,如果我们可以直接对这些细胞表面的过程进行观测,而不受到来自细胞内深层区域信号的干扰,这对细胞生物学研究来说,将是具有重大意义的突破。全内反射荧光显微术正是凭借其独特的优势,它的荧光激发深度只在100nm的薄层范围内,从而成为研究细胞表面科学如生物化学动力学、单分子动力学的最有前途的光学成像技术。

在前面已经介绍过的宽场荧光显微技术的配置的基础上,引入单波长的或多波长的激光作为激发光源,利用双端口聚光器,使T IRF激发光束与宽场激发光束共用同一光路。使用N A=1.45或1.65的高数值孔径物镜,将激光光束聚焦到样本平面,并且产生全内反射,得到隐失场。物镜型全内反射系统中,发生全内反射时,激光光束被约束在物镜内部,对实验人员的辐射威胁小。而且样品的放置非常方便,并且在对样品的控制上可与多种其它技术相结合,例如和宽场照明,光镊光刀技术操纵样本粒子等等,具有更加灵活广泛的应用范围。由于全内反射荧光成像的独特优势,它

68张少华,曹福元,胡茂琼