植物悬浮细胞系的建立

细胞鲜重测定 将悬浮培养物倒在已知重量的滤纸上，用去离子水洗 去培养基。真空抽滤除去细胞上沽着的多余水分，然 后称重细胞鲜重= 鲜细胞和湿滤纸的质量- 湿滤纸质量
• 细胞密度测定 • 每2d用吸管取 悬浮培养细胞 ，用5%铬酸处 理后，将其分 散均匀，然后 用血球计数板 进行细胞技术 并绘制曲线
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桑树悬浮细胞分裂指数测定 每2d取悬浮培养细胞，加入少量5%铬酸，使细胞分散均匀。滴一滴细胞悬浮 液于载玻片上，滴一滴醋酸洋红染液，盖上盖玻片，在酒精灯上微热则细胞核 被染上色而胞质无色，于光镜下观察技术1000个以上细胞，记录分裂期和分裂 间期细胞个。 细胞分裂指数（%）=[分裂期细胞数／细胞总数]×100%
植物细胞悬浮培养操作过程
悬浮培养特点
除气体和挥发性代谢物外， 其他都是密闭的 细胞生长呈S形曲线 需要不断继代
影响悬浮培养的因素
初始接种量 培养基种类及不同激素的浓度 蔗糖浓度 培养条件（温度、摇床转速） 继代周期
生理参数的测定确定继代时期
㈠ ㈡ ㈢ ㈣ ㈤ 细胞鲜重 细胞干重 细胞分裂指数测定 细胞密度测定 细胞活力测定
成功的悬浮培养体系的三个基本条件
悬浮细胞培养物分散性好,细胞团较小 均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相 同，悬浮系外观为大小均一的小颗 生长速度，悬浮细胞的量一般2-3d可增加 一倍
香花槐愈伤组织 及悬浮培养的细胞
悬浮培养的基本形式
1 分批培养：将愈伤组织培养在一定容积的密闭容 器中，最后一次收获的培养方式。 2 连续培养：将愈伤组织培养在一个恒定容积的流 动系统中，以使培养系统中的细胞数量和营养状态 保持稳定。 流动系统：一方面以一定速率不断地加入新的培养 基，另一方面又以相同的速率流出培养物（菌体和 代谢产物）
3 野生甘草资源濒危与甘草需求量日益增加的 供求矛盾，悬浮细胞培养具有繁殖速度快、能 进行大规模培养和可提供较大量均一一致的植 物培养物、并进行植物次生代谢物的生产的优 点。 总之，建成的悬浮系细胞增殖速度快、重复性 好、在基因遗传转化、原生质体的分离、培养 和杂交、突变体筛选以及人工种子等方面有着 广泛的应用，成为现代植物新品种培育的有效 工具之一。
植物悬浮细胞系的建立
青竹 生命学院 植物学2010级
定义：植物细胞或小的细胞聚集体 在液体培养基上，于摇床上进行悬 浮培养。 意义 1 细胞可以不断增殖，形成高密度 的细胞群体，适于大规模的培养; 2 能够提供大量较为均匀的细胞， 为研究细胞的生长、分化创造方法 和条件。
研究中的应用：
1 高羊茅作为冷季型坪草，是极具开发潜力的 草坪品种。但存在叶片粗糙、夏季生长缓慢、 易遭杂草侵害。尝试利用遗传转化手段改良其 品质性状。胚性悬浮细胞系生长迅速、重复性 好、易于控制等，以此为受体获得转基因高羊 茅，可在短期内在细胞水平筛选预期突变体 2 水稻悬浮系具有繁殖速度快、颗粒均一、操 作方便等优点，成为水稻转基因的理想受体之 一，也是水稻原生质体高Biblioteka Baidu分离、体细胞融合 和高效再生的关键。
细胞活力的测定方法
• • • • 相差显微术法 伊凡蓝法 FDA法 TTC法
继代方法
• 用注射器或移液管吸取一定量的含单细胞 和小细胞团的悬浮培养物，并移到含有新 鲜培养基的培养瓶里，继续进行培养。
操作注意事项： 对悬浮细胞继代时，进液口的孔径要小， 只能通过单细胞或小细胞团。 继代前，培养容器静置短时间，大细胞团 沉降，再吸取上层悬浮液。 依次，多次，可建立良好的细胞悬浮液