第五章 重组蛋白质表达与纯化

第五章重组蛋白质的表达、复性与纯化

为什么要重组基因表达？

1.蛋白质功能研究

2.生物制药和疫苗生产

3.疾病的基因治疗

4.食品、化工用酶制剂

5.抗虫、抗逆植物改良

6.细胞代谢产物的富集

•基因表达体系及优劣势•大肠杆菌表达体系•蛋白质的复性

•工作中经常碰到的问题

基因表达体系

1.原核体系

2.真核体系

大肠杆菌(Escherichia coli)•遗传背景清楚，基因工程操作方便，商品化表达载体种类齐全，表达效率高；

•基本不分泌，易形成包含体(无正确折叠的立体结构)，无加糖等修饰

枯草杆菌(Bacillus subtilis)

•分泌蛋白质能力强，一般有天然立体结构；

•无加糖修饰功能，培养液中蛋白酶活性高，重组蛋白易受蛋白酶的水解；

•质粒不稳定，已有商品化的表达载体（枯草芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌）。

其他

•乳酸菌(Lactic acid bacteria)•沙门氏菌(Salmonella typhimurium)•苏云金杆菌

(Bacillus thuringiensis)

真核细胞表达体系酵母细胞

昆虫细胞

植物细胞/组织

哺乳动物细胞/组织

酵母细胞

•可生产分泌型蛋白；有天然立体结构，有糖基化修饰功能；可进行染色体整合型基因表达;

•糖链与哺乳动物加工的不一致，培养上清多糖浓度高;

•商品化表达体系：

酿酒酵母（Saccharomyce cerevisiae）;

毕氏酵母(Pichia pastoris);

裂殖酵母（Schizosaccharomyce pombe）

蛋白质糖基化的分类

1.O-糖基化:糖链通过GalNAc连接在蛋白质的Ser 或Thr等侧链的羟基处

2.N-糖基化:糖链连接在Asn-X-Ser或Asn-X-Thr （X是除Pro以外的任何氨基酸）中Asn的氨基侧链处

3.GPI-Anchor糖基化:蛋白质通过肽链的C端共价连接的糖基磷脂酸肌醇锚定在膜脂上。

昆虫细胞

•可以病毒感染的形式在成虫中生产，也可在体外培养细胞生产蛋白;

•适合分泌型和膜蛋白的表达，有加糖修饰；

•糖链有所区别，表达量有限；

•作为药物宿主细胞未被FDA认可

CHO细胞

•可进行分泌表达，有天然立体结构，加糖方式与人体蛋白质完全一致；•表达量不够高，培养成本较高

植物组织

•植物可大面积种植，可以廉价大规模生产；

•转基因植物制作费时，表达的组织特异性较难控制；•表达量较难提高，分离纯化不方便

动物乳腺组织

•分泌生产有天然立体结构和活性的蛋白质至乳汁，产量高，分离纯化方便，特别适合药用蛋白的生产；

•转基因动物制作花费巨大，实验周期长

鸟类输卵管组织

•分泌生产有天然立体结构的蛋白质到蛋清，产量高，容易贮存和运输，分离纯化方便；

•实验成本低，饲养费用低；

•加糖方式可能与人有所不同

体系选择

研究基因功能:

大肠杆菌,裂殖酵母,昆虫细胞,CHO细胞多肽药物生产:

大肠杆菌,毕氏酵母,CHO细胞,乳腺组织疫苗:大肠杆菌,酵母,

大多数沿用细胞培养产物进行灭毒单抗生产:杂交瘤细胞

工业酶生产:各种微生物

有可能以后能做到的事∙在大肠杆菌中直接生产有活性的胰岛素

∙在大肠杆菌中生产人凝血IX因子

∙在大肠杆菌生产Calcitonin类C端酰胺化短肽

∙在大肠杆菌中进行蛋白质的糖基化修饰

∙在酵母中进行与哺乳动物细胞一致的糖基化

∙在鸡输卵管中进行与哺乳动物细胞一致的糖基化∙提高乳腺分泌表达的Factor IX类因子的活性

∙在植物中得到与哺乳动物细胞一致的糖基化

在大肠杆菌中表达重组蛋白质

•如果目的蛋白质有二硫键并需要正确的立体结构, 尽可能进行可溶性表达;

•如果目的蛋白质没有二硫键或只用来制备抗血清, 采用包含体表达比较好;

•如果目的多肽的分子量小于10 kDa, 一定要进行融合表达

大肠杆菌表达载体分类

按蛋白质类型分

•单纯表达: pJLA系列, 用NcoI/NdeI导入AUG的载体•融合表达: 融合各种tag, GST, CBD, MAL, GFP, etc •分泌表达: pel/ompT分泌肽

按启动子分

•lac及衍生的tac , trc, pac, rac等启动子IPTG诱导•lamda phage P L和P R启动子热诱导•T7 启动子IPTG诱导•T5 启动子IPTG诱导•ara启动子阿拉伯糖诱导

常用表达载体•pJLA50X 系列; pcDNAII; etc •pET 系列(T7 promoter, Novagen 公司)•pQE系列(T5 promoter, Qiagen公司)•pMAL系列(周质表达, BioLabs公司)•pGEX系列(GST融合表达, Pharmacia公司)•pBAD系列(Arabinose诱导型)•pTYB系列(CBD融合, 可以自我切割, BioLabs)

各种融合蛋白表达载体•Protein A

•GST（glutathione S-transferase）

•CBD (chitin-binding domain, BioLabs;

cellulose-binding domain, Novagen)

calmodulin-binding domain, Stratagene)•MBP (maltose-binding protein)

•GFP (green fluorescence protein)•Thioredoxin **帮助二硫键形成

•Dsb (periplasmic enzyme DsbA, DsbC) ** 二硫键的形成与•SUMO (small ubiquitin-related modifier) •KSI (ketosteroid isomerase) 基本上全部沉淀可用亲和层析纯化

帮助可溶化帮助分泌到周质