发酵工艺学整理资料

发酵工艺学整理资料

1、发酵工程的概念:指利用微生物的生长繁殖与代谢活动来大量生产人们所需产品过程

的理论与工程体系。

2、发酵工程的内容:微生物菌种选育与保藏,培养基与发酵设备的灭菌技术,空气

净化技术,菌种的扩大培养,代谢产物发酵生产,发酵过程中参数检测、分析与控制

技术,发酵过程中补料技术,产品分离纯化技术

3、巴斯德证明了酒精就是由活的酵母发酵引起的

4、发酵产品的类型:

A微生物菌体发酵目的:获得微生物菌体细胞例如酵母与藻类、担子菌、

苏云金芽杆菌、疫苗等特点:细胞的生长与产物积累成平行关系,生长稳定期产

量最高。

B微生物酶发酵目的:获得酶制剂与酶调节剂例如青霉素酰化酶、糖苷酶抑

制剂特点:需要诱导作用,或遭受阻遏、抑制等调控作用的影响,在菌种选育、

培养基配制以及发酵条件等方面需给予注意

C微生物代谢产物发酵: 包括初级代谢产物(无种属特异性)与次级代谢产物(微

量、有种属特异性、特殊活性)

D微生物转化发酵

生物转化:就是利用生物细胞对一些化合物某一特定部位(基团)的作用,使它转变

成结构相类似但具有更在经济价值的化合物

实质:利用微生物代谢过程中的某一酶或酶系将一种化合物转化成含有特殊功能

集团产物的生物化学反应。

E基因工程发酵 F 动、植物细胞产物的发酵

5、发酵的方法:

A表面发酵培养

固体表面发酵培养:投资小、设备少、简单易行、适于小型化生产

B液体深层发酵培养

微生物细胞在液体深层中进行纯种培养的过程

6、液体深层发酵流程

保藏菌种斜面活化扩大培养种子罐主发酵产物分离纯化

成品7、微生物转化与发酵的区别

发酵就是通过微生物的生长繁殖与代谢活动,产生人们所需产品的过程。其核

心就是微生物

8、菌种选育的目的:

提高发酵产量;改进菌种性能;去除多余组分;产生新的发酵产物

9.菌种选育基本理论:遗传与变异;遗传与变异的物质基础;基因突变的本质

10.菌种选育技术:

A自然选育用途:分离、纯化、复壮菌种

B诱变育种用途:发酵工业广泛应用

C 原生质体融合用途:有两个合适亲本时的菌种选育

D基因工程育种用途:清楚微生物的遗传背景时的菌种选育

11.菌种退化与变异的原因

A遗传基因型的分离要点:遗传物质的多样化,群体繁殖

B 自发突变的结果可能原因:1)沙土管长期保藏2)连续传代3)新陈代谢产生的

诱变物质 4)增变基因、死亡基因的存在

C 经诱变剂处理后的退化变异。

12. 自然选育流程图

C 诱变剂及诱变剂剂量的选择:

诱变剂种类选择:

①对遗传稳定的出发菌株,最好采用以前未使用过的、 突变谱较宽的、诱变率高的强诱变剂(NTG, EMS)。

②对遗传不稳定的出发菌株,采用温与诱变剂(UV)。

③对诱变史较长的高产菌株,如多次使用某一诱变剂,可能出现“钝化”现象,此时则需改用另外的诱变剂。

最佳剂量的选择:常以杀菌率来表示相对剂量(剂量-存活率曲线) 。在产量变异工作中,常采用相对杀菌率为75~85%, 甚至90~99、9%的剂量。但对多核细胞菌株,一般用高剂量处理

,便于形成较纯的菌落与增加多细胞菌株的稳定性

D 突变株的筛选:随机筛选与理性筛选

随机筛选之一:摇瓶筛选:初筛一般就是一个菌株只做一个摇瓶,从大量菌株中选出10-20%较好的菌株,淘汰80-90%的菌株;而复筛中摇瓶培养一般就是一个菌株培养3瓶,并要重复3-5次,选出3-5个较好的菌株,再做进一步比较,选出最佳的菌株

随机筛选之二; 琼脂块筛选法 之三:自动化筛选

13. 营养缺陷型菌株的浓缩:一般包括:诱变处理、中间培养、淘汰野生型菌株、检出营养缺

陷型、鉴定营养缺陷型的种类等5个步骤

14. 淘汰野生型的方法有抗生素法与菌丝过滤法

抗生素法:常用于细菌与酵母菌营养缺陷型菌株的富集,前者用青霉素法,后者用制霉菌素法。青霉素作用细菌的原理:未曾突变的野生型在基本培养基上能生长,突变为营养缺陷型的菌株被抑制。营养缺陷型菌株在基本培养基上不生长,也不分裂,因此不受青霉素的作用而保存。制霉菌素作用真菌的机理:制霉菌素可与真菌细胞膜上的甾醇作用,从而引起膜的损伤,也就是只能杀死生长繁殖着的酵母菌或霉菌。在基本培养基中加入抗生素,野生型生长被杀死,营养缺陷型不能在基本培养基中生长而被保留下来

菌丝过滤法:原理:真菌与放线菌等丝状菌的野生型孢子在基本培养基中能萌发长成菌丝,

13诱变育种步骤:

出发菌株的选择;处理菌悬液的制备;诱变处理;中间培养;分离与筛选

A 出发菌种的选择:选择纯种(平均发酵单位要高,且发酵单位的波动幅度要小,摇瓶间所测得结果的最高值与最低值之差要小);有良好的代谢特性;选择对诱变剂敏感的菌;株选用多个出发菌株进行诱变收效较快;选择单倍体细胞;选择单核或细胞核尽量少的细胞(真菌中多采用分生孢子或孢子囊孢子进行诱变,避免分离型表型延迟)

B 单细胞悬液的制备:通常采用生理盐水。如果用化学诱变剂处理时,应采用相应的缓冲液配制,以防处理过程中pH 变化而影响诱变效果。

而营养缺陷型的孢子则不能萌发。

步骤:诱变处理后的孢子→基本培养液(培养10 h左右) →用灭菌的脱脂棉→除去菌丝→继续培养→每隔3-4 h过滤一次,重复3-4次→稀释→涂皿分离。

15、营养缺陷型菌株的检出方法:逐个检出法、夹层培养法、限量补充培养法与影印接种法

逐个检出法:诱变后的孢子或菌体→富集培养→涂布分离在完全培养基平板上培养→待菌落孢子成熟后,用灭菌的牙签把孢子或菌体分别接到基本培养基与完全培养基平板上的相应位置→同时培养→然后观察对比菌落生长情况。如果基本培养基上不生长而完全培养基相应位置上生长的菌落为营养缺陷型。挑取孢子或菌体分别移接到基本培养基与完全培养基斜面上,进一步复证

夹层法: 先在培养皿底部倒入一层基本培养基→倒入含有菌体细胞的基本培养基→加第三层基本培养基→培养→平板上首先出现的菌落,为野生型菌落(在平皿底部做好颜色标记) →加上第四层完全培养基→经培养→如果在基本培养基上不长而在完全培养基上生长的小型菌落,可能就是营养缺陷型。

限量补充培养法:如果试验的目的仅就是检出营养缺陷型菌株,则其方法就是将富集培养后的细胞接种到含有0、01％蛋白胨的基本培养基上,培养后,野生型细胞迅速地长成大菌落,在平皿底部作好颜色标记,而生长缓慢的小菌落可能就是缺陷型,此称为限量培养; 如果试验目的就是要定向筛选某种特定的缺陷型,则可在基本培养基中加入某种单一的氨基酸、维生素或碱基等物质,称为补充培养。补充这些物质的数量可根据已有缺陷型进行测定后加以确定。16抗性突变株的分离:主要包括:抗药性突变株、抗噬菌体突变株、抗结构类似物突变株

为了简化初筛步骤,常用的方法:根据形态突变淘汰低产菌株。变色圈法:对于一些不易产生透明圈产物的产生菌,可在底物平板中加入指示剂或显色剂,使所需微生物能被快速鉴别出来。生长圈法:通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸与维生素的产生菌。抑菌圈法:常用于抗生素产生菌的分离筛选

17氨基酸生产菌的定向育种思路:切断或减弱支路代谢;解除自身的反馈抑制;增加前体物的合成;利用特殊调节机制;去除终产物

A切断或减弱支路代谢实现方式:营养缺陷突变株的应用、渗漏缺陷突变株

B选育抗反馈调节突变株优点:不受培养基成分的影响,生产较稳定;选育结构类似物抗性突变株,简单易得;易于保存而不易发生回复突变

方法一:选育结构类似物抗性突变株机理:作为假反馈抑制剂,作为假反馈阻遏剂

影响突变率的因素:菌种遗传特性,菌种细胞壁结构,培养条件与环境条件

方法二:利用酶底物专一性宽的育种策略:则可利用该酶对其它底物的活性,选育代谢调节突变株。例:在添加了乙酰赖氨酸与过量精氨酸的戴维斯发酵培养基中,接种赖氨酸缺陷型(Lys-)菌株,经培养,从出现的生长菌落中能够获得精氨酸合成酶系的解阻遏突变株

C增加前体物的积累通过选育某些营养缺陷型或结构类似物杭性突变株,增加目的产物的前体物的合成,有利于目的产物的大量积累。

D利用特殊调节机制育种: 平衡合成、代谢互锁

平衡合成:一个产物阻遏酶,一个产物激活酶

代谢互锁:分支途径上游的某个酶受到另一条分支途径的终产物,甚至于本分支途径几乎不相关的代谢中间物的抑制或激活,使酶的活力受到调节,即为代谢互锁。这种作用只在高浓度下才发生,且此调节作用就是部分的,不完全的

E除去终产物:改变细胞膜通透性

18、原生质体具有的特性:对诱变剂敏感,对噬菌体不敏感,不受感受态影响

包括原生质体再生育种,原生质体诱变育种,原生质体转化育种,原生质体融合育