转基因技术原理与方法PPT课件
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动子、前导顺序、增强子、加尾信号等DNA调控元 件。
25
质粒载体
质粒（plasmid）是能自我复制的双链环状DNA分 子，它们在细菌中以独立于染色体外的方式存在。
每个质粒都有一段DNA复制起始位点的序列，它 能帮助质粒DNA在宿主细胞中复制。
高拷贝数的质粒，在宿主细胞中能达10～100个拷 贝；低拷贝数的质粒，在宿主细胞中只有1－4个 拷贝。
质粒要成为克隆载体，就必须进行遗传改造，使 之成为一个具有单一的限制性内切酶识别位点、 多个选择性标记。
26
质粒载体pBR322
1.大小为4361bp，含有抗氨 苄青霉素和抗四环素这样两 个抗生素抗性基因
2.在四环素抗性基因内部， 还具有BamH I、Hind Ⅲ和 Sal I 三个识别位点。
14 2019/5/30
Copyright© Jiangyong
转基因猪
15 2019/5/30
Copyright© Jiangyong
16 2019/5/30
17
转基因熊猫狗 18
转基因技术
王海玲 转基因研究技术的中心环节即为DNA重组技术，其最终目的 是将DNA片段转入为一个生物体，从而使该生物体具有表现 某种性状。
彩色玉米
10 2019/5/30
Copyright© Jiangyong
巨型鲑鱼
11 2019/5/30
Copyright© Jiangyong
荧光鱼
12 2019/5/30
Copyright© Jiangyong
超级奶牛
13 2019/5/30
Copyright© Jiangyong
培育出人耳的小鼠
在λ噬菌体基因组中位于左边的基因（A-J）编码 噬菌体头部和尾部的蛋白质，中间的基因（J-N） 与重组和生长过程有关，但与裂解生长过程无关， 因此对裂解生长过程来说，中间区的DNA是非必 需的，可以被缺失或置换，因此可以在这个区域 克隆外源DNA，右边的基因涉及λ基因的表达、调 节、DNA合成晚期功能调节以及宿主细胞裂解等。
pUC19的筛选将转化细胞涂布到 含有氨苄青霉素、IPTG和X－ gal的固体培养基上，那些带有 自身环化质粒的细胞由于能够形 成具活性的β－半乳糖苷酶，所 以菌落是蓝色，如果插入有目的 DNA片段，无法形成杂合β－半 乳糖苷酶，菌落时白色的。
28
λ噬菌体
λ噬菌体染色体是长约49kb的双链DNA，该DNA 的两个5’末端都是由12个bp组成的单链互补粘性 末端，当λ噬菌体DNA进入宿主细胞后，这两个粘 性末端互相结合，在连接酶作用下封闭成环
3.Pst I识别位点在氨苄青霉 素抗性基因
4.pBR322带有一个复制起 点，可以保证质粒只在大肠 杆菌里进行复制功能。
27
pUC19质粒
长2686bp，带有pBR322的复制 起始位点，一个氨苄青霉素抗性 基因和一个大肠杆菌乳糖操纵子 β－半乳糖苷酶基因（lac Z’）的 调节片段，一个调节lac Z’基因 表达的阻碍蛋白的基因lac I，还 有多个单克隆位点。
24
2.良好载体需要满足的条件
1、必须有自身的复制子； 2、载体分子上必须有限制性核酸内切酶的酶切位
点，即多克隆位点，以供外源DNA的插入； 3、载体应具有可供选择的遗传标志，以区别阳性
重组子和阴性重组子； 4、载体分子必须有足够的容量； 5、可通过特定的方法导入细胞； 6、对于表达载体还应具备与宿主细胞相适应的启
金大米
6 2019/5/30
Copyright© Jiangyong
地雷探测草
拟南芥
7
2019/5/30
Copyright© Jiangyong
不会引起过敏的大豆
8 2019/5/30
Copyright© Jiangyong
转基因芥菜可减轻土壤污染
9 2019/5/30
Copyright© Jiangyong
载体：质粒、λ噬菌体 、柯氏质粒 、YAC载 体等
工具酶：限制性内切酶、连接酶、DNA聚合 酶等
23
1.目的基因的分离
（1）已知基因的获得
①化学合成法 ②PCR扩增
（选目的基因 ③mRNA差异显示技术筛选差异表达基因 ④差异蛋白质谱表达技术筛选功能基因 ……
29
λ噬菌体载体
分类：插入型载体和置换型 载体。
插入型载体：具有单一的酶 切位点，可供外源DNA的 插入。
置换型载体：有成对的酶切 位点，在两个酶切位点之间 的DNA片段，可被外源 DNA片段置换。
λ噬菌体载体可以克隆较大 DNA片段，最大长度约为 24kb，只需将λ噬菌体DNA、 尾巴和纯化的空的头，混在 一起就可以在体外产生具有 侵染性的噬菌体颗粒。
转基因通过获取基因、重组基因和表达基因等过程来实现。 转基因打破了物种的界限，使不同种的生物的遗传物质在分
子水平上重新组合在一起，并且完全可以按照人的意志或目 的，实现对生物体的改造。
20
转基因的方法和原理
目的基因制备和载体系统 几种有效的转基因方法 转基因生物的筛选与鉴定
21
基本步骤
1.分离获得目的基因； 2.在体外进行DNA重组，将外源DNA连接到
能自我复制又带有选择标记的载体上； 3.将重组DNA转移入受体细胞； 4.筛选出含有目的DNA的受体细胞克隆；
22
1、目的基因制备和载体系统
目的基因来源：基因组DNght© Jiangyong
转基因西红柿
1 2019/5/30
Copyright© Jiangyong
抗虫害作物
2 2019/5/30
Copyright© Jiangyong
3 2019/5/30
4
Copyright© Jiangyong
番木瓜优良抗病品种
5 2019/5/30
Copyright© Jiangyong
30
柯氏质粒 Cosmid
柯氏质粒可克隆携带40kb大 小的DNA片段，并在大肠杆 菌中复制保存，综合了质粒 载体和噬菌体载体二者的优 点。
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质粒载体
质粒（plasmid）是能自我复制的双链环状DNA分 子，它们在细菌中以独立于染色体外的方式存在。
每个质粒都有一段DNA复制起始位点的序列，它 能帮助质粒DNA在宿主细胞中复制。
高拷贝数的质粒，在宿主细胞中能达10～100个拷 贝；低拷贝数的质粒，在宿主细胞中只有1－4个 拷贝。
质粒要成为克隆载体，就必须进行遗传改造，使 之成为一个具有单一的限制性内切酶识别位点、 多个选择性标记。
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质粒载体pBR322
1.大小为4361bp，含有抗氨 苄青霉素和抗四环素这样两 个抗生素抗性基因
2.在四环素抗性基因内部， 还具有BamH I、Hind Ⅲ和 Sal I 三个识别位点。
14 2019/5/30
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转基因猪
15 2019/5/30
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16 2019/5/30
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转基因熊猫狗 18
转基因技术
王海玲 转基因研究技术的中心环节即为DNA重组技术，其最终目的 是将DNA片段转入为一个生物体，从而使该生物体具有表现 某种性状。
彩色玉米
10 2019/5/30
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巨型鲑鱼
11 2019/5/30
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荧光鱼
12 2019/5/30
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超级奶牛
13 2019/5/30
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培育出人耳的小鼠
在λ噬菌体基因组中位于左边的基因（A-J）编码 噬菌体头部和尾部的蛋白质，中间的基因（J-N） 与重组和生长过程有关，但与裂解生长过程无关， 因此对裂解生长过程来说，中间区的DNA是非必 需的，可以被缺失或置换，因此可以在这个区域 克隆外源DNA，右边的基因涉及λ基因的表达、调 节、DNA合成晚期功能调节以及宿主细胞裂解等。
pUC19的筛选将转化细胞涂布到 含有氨苄青霉素、IPTG和X－ gal的固体培养基上，那些带有 自身环化质粒的细胞由于能够形 成具活性的β－半乳糖苷酶，所 以菌落是蓝色，如果插入有目的 DNA片段，无法形成杂合β－半 乳糖苷酶，菌落时白色的。
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λ噬菌体
λ噬菌体染色体是长约49kb的双链DNA，该DNA 的两个5’末端都是由12个bp组成的单链互补粘性 末端，当λ噬菌体DNA进入宿主细胞后，这两个粘 性末端互相结合，在连接酶作用下封闭成环
3.Pst I识别位点在氨苄青霉 素抗性基因
4.pBR322带有一个复制起 点，可以保证质粒只在大肠 杆菌里进行复制功能。
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pUC19质粒
长2686bp，带有pBR322的复制 起始位点，一个氨苄青霉素抗性 基因和一个大肠杆菌乳糖操纵子 β－半乳糖苷酶基因（lac Z’）的 调节片段，一个调节lac Z’基因 表达的阻碍蛋白的基因lac I，还 有多个单克隆位点。
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2.良好载体需要满足的条件
1、必须有自身的复制子； 2、载体分子上必须有限制性核酸内切酶的酶切位
点，即多克隆位点，以供外源DNA的插入； 3、载体应具有可供选择的遗传标志，以区别阳性
重组子和阴性重组子； 4、载体分子必须有足够的容量； 5、可通过特定的方法导入细胞； 6、对于表达载体还应具备与宿主细胞相适应的启
金大米
6 2019/5/30
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拟南芥
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9 2019/5/30
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工具酶：限制性内切酶、连接酶、DNA聚合 酶等
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1.目的基因的分离
（1）已知基因的获得
①化学合成法 ②PCR扩增
（选目的基因 ③mRNA差异显示技术筛选差异表达基因 ④差异蛋白质谱表达技术筛选功能基因 ……
29
λ噬菌体载体
分类：插入型载体和置换型 载体。
插入型载体：具有单一的酶 切位点，可供外源DNA的 插入。
置换型载体：有成对的酶切 位点，在两个酶切位点之间 的DNA片段，可被外源 DNA片段置换。
λ噬菌体载体可以克隆较大 DNA片段，最大长度约为 24kb，只需将λ噬菌体DNA、 尾巴和纯化的空的头，混在 一起就可以在体外产生具有 侵染性的噬菌体颗粒。
转基因通过获取基因、重组基因和表达基因等过程来实现。 转基因打破了物种的界限，使不同种的生物的遗传物质在分
子水平上重新组合在一起，并且完全可以按照人的意志或目 的，实现对生物体的改造。
20
转基因的方法和原理
目的基因制备和载体系统 几种有效的转基因方法 转基因生物的筛选与鉴定
21
基本步骤
1.分离获得目的基因； 2.在体外进行DNA重组，将外源DNA连接到
能自我复制又带有选择标记的载体上； 3.将重组DNA转移入受体细胞； 4.筛选出含有目的DNA的受体细胞克隆；
22
1、目的基因制备和载体系统
目的基因来源：基因组DNght© Jiangyong
转基因西红柿
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抗虫害作物
2 2019/5/30
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3 2019/5/30
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番木瓜优良抗病品种
5 2019/5/30
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30
柯氏质粒 Cosmid
柯氏质粒可克隆携带40kb大 小的DNA片段，并在大肠杆 菌中复制保存，综合了质粒 载体和噬菌体载体二者的优 点。