染色体微阵列分析在单纯不良孕产史孕妇产前诊断中的应用(全文)

染色体微阵列分析在单纯不良孕产史孕妇产前诊断中的应用（全文）
我国母婴保健法规定，对曾经分娩过先天性严重缺陷婴儿的孕妇应进行产前诊断[1]。

先天缺陷儿发生的病因复杂，遗传学异常是造成先天缺陷的重要原因。

目前产前遗传学诊断的主要方法是染色体微阵列分析（chromosomal microarray analysis, CMA），其检测范围包括了部分染色体病和基因组病，一些临床指南认为该技术可用于所有需要产前诊断的孕妇[2-3]。

由此产生了一种认知，认为不良孕产史的孕妇均需要进行产前CMA检测。

然而，不良孕产史的遗传学病因复杂多样，包括染色体病、基因组病、单基因病等，而CMA并不能覆盖所有遗传异常。

对于不同病因造成的不良孕产史，再次妊娠时，如胎儿未出现明确的CMA检测指征（如超声结构异常）时，CMA检测是否可成为普适性的检测值得思索。

本研究总结单中心6年间单纯因“不良孕产史”行CMA检测的病例，分析不同先证者遗传学病因时CMA产前诊断的异常检出情况，探讨CMA 在单纯不良孕产史孕妇中应用的注意事项。

一、资料与方法
1.研究对象：2014年6月至2020年7月间，共5 563例孕妇在南京大学医学院附属鼓楼医院应用CMA进行产前诊断，本研究回顾性纳入其中单纯因“不良孕产史”[既往生育/妊娠异常患儿/胎儿（遗传学诊断明确或不明确）]进行产前诊断的病例。

纳入标准：既往生育或妊娠
出生缺陷患儿，本次妊娠已进行超声检查确定宫内妊娠，且暂未发现胎儿有明确异常。

排除标准：（1）此次妊娠产前筛查实验提示“高风险”；（2）不良孕产史仅是反复早孕期自然流产。

最终纳入孕妇169例（胎儿172例），包括2例双胎妊娠孕妇和1例孕妇2次单胎妊娠。

所采集样本27例为绒毛，145例为羊水。

孕妇年龄为（32.3±4.68）岁（23~53岁）。

2. CMA检测方法：基因组DNA提取、CMA实验及分析、验证流程按本中心常规操作流程[4]进行。

所用芯片为Affymetrix CytoScan 750K（美国ThermoFisher公司），分析软件为ChAS 4.0。

拷贝数变异（copy number variations, CNVs）的性质主要依据ClinGen2019年颁布的指南[5]进行判读。

CNVs的报告标准为：（1）在具有重要临床意义的区域，DNA拷贝缺失≥100 kb；（2）在已知具有重要临床意义的区域外，连续DNA拷贝缺失达500 kb以上，连续拷贝重复达1 MB以上（在这些区域内的探针密度达到每100 kb 具有20个以上探针，同时存在一个在线人类孟德尔遗传基因）。

3.分组及分析：根据先证者遗传学异常的类型和遗传来源以及CMA 预期检出情况，分为高风险组、低风险组和风险不明组。

高风险组19例，包括先证者为父母来源的病理性CNVs 11例，先证者为父/母来源的染色体异常8例；低风险组113例，包括先证者全外显子测序和/或CMA未发现异常6例，先证者为明确的单基因病31例，新发致
病性CNVs 47例，新发染色体异常29例；风险不明组40例，先证者均未进行遗传学检测。

见表1。

二、结果
172例胎儿中，CMA共检出异常9例，占5.2%。

见表1。

1.高风险组：19例中检出异常8例。

其中先证者为遗传性CNVs者11例中，检出6例胎儿异常，均与父母所携带的异常相关。

先证者为父母来源的遗传性染色体异常8例中检出异常2例。

其中1例（表2例7）因前次妊娠外院CMA提示4p-三体要求产前诊断，行CMA检测前未行超声结构筛查和双亲遗传学检测，羊水CMA提示arr[GRCh37] 4p16.3q11(68,345-52,685,982)×3，夫妻双方染色体检查提示男方染色体为46,XY,t(4;14)(p10;q10)，证明胎儿CMA异常与其父亲染色体异常相关；另1例（表2例8）CMA提示为21-三体，先证者胎儿染色体为46,XX,+21,der(21;21)(q10;q10)，夫妻双方染色体检查发现男方染色体为45,XY,der(21;21)(q10;q10)。

CMA检出异常胎儿情况见表2。

2.低风险组：113例中检出1例异常（表2例9），CMA结果为arr[GRCh37]22q11.22q11.23(22,997,928- 25,002,659)×3，为22q11.22q11.23微重复，属于新发变异，该家系先证者为Duchenne 肌营养不良（Duchenne muscular dystrophy, DMD）基因变异。

3.风险不明组：未检出CMA异常胎儿。

三、讨论
CMA除可检出染色体水平的剂量改变外，还可检出传统G显带染色体分析无法检出的亚显微水平的变异，分辨率提高了近100倍。

CMA 可检出100~400 kb以上的基因组不平衡改变（缺失/重复），包括染色体非整倍体改变、整倍体改变以及基因组小片段缺失或重复。

1.CMA可作为染色体异常或基因组不平衡家系产前诊断的一线方法：经典的细胞遗传学理论认为，相互易位个体可形成18种配子，仅2种为基因组平衡的配子[6]。

但是由于其中一些配子无法受孕，因此对于大多数易位来说，活产儿异常的风险小于理论风险。

一般来说，因活产儿异常而进行双亲染色体检查发现的易位携带者，再孕时约有5%~30%的风险生育基因组不平衡的后代[7]。

本研究中8例因双亲之
一染色体易位而导致不良孕产史的孕妇中，1例在早孕期行绒毛活检CMA检查时发现了与易位相关的病理性变异，继而在中孕期超声检查中发现“胎儿室间隔缺损”；另1例父亲染色体异常[45,XY,der(21;21)(q10;q10)]，理论上分裂时可产生带der(21;21)(q10;q10)和不带der(21;21)(q10;q10)（即21号染色体缺失）的2种配子。

由于21-单体胚胎难以存活，因此可存活至中孕期的几乎都是21-三体。

当然，对于染色体相互易位造成子代不平衡易位而导致的表型效应，应进行个体分析。

本组病例数有限，尚不足以展开讨论。

需要注意的是，CMA无法区分平衡易位携带者和核型正常者。

亲本来源的CNVs，理论上再发风险为50%。

本研究中，11例先证者的CNVs由父/母遗传而来，再次妊娠时产前CMA检测检出6例异常。

即使在同一家系中，携带同一CNVs的个体之间，也可出现表型的差异。

因此，不能以亲本的表型来推测胎儿的表型。

胎儿表型因受到发育阶段和影像学检查的局限，即使CNVs与超声结构异常高度相关，通常也需要在中晚孕期才能发现，如本研究中17q12缺失的多囊肾家系（表2例1）。

对于遗传性CNVs，早孕期通过绒毛穿刺进行CMA 检测，可以将诊断时间大大前移。

因此，CMA检测可作为这一组孕妇的一线产前检测手段[3]。

2.低风险组孕妇CMA异常检出率与无产前诊断指征孕妇相当：大样本临床研究和meta分析发现，即使羊水染色体核型正常，超声也没有异常发现，CMA仍可检出0.5%~1.7%的病理性变异[8-9]，因此美国母胎医学会认为所有进行侵入性产前诊断的孕妇均可选择CMA[10]。

我国最新发布的“拷贝数变异检测在产前诊断中的应用指南”也明确列出了若干适应证，不明原因的不良孕产史即是适应证之一[3]。

本研究113例低风险孕妇中仅1例孕妇在进行羊水单基因病（前一胎儿DMD基因变异，孕妇为携带者）检测同时行CMA，意外检出胎儿新发22q11.22-q11.23重复，该变异携带者个体表型轻重不等，呈现出从正常至严重发育落后、语言发育迟缓的谱系。

低风险组孕妇总体胎儿CNVs异常检出率为0.9%（1/113），与文献报道的无指征或单纯高龄孕妇CMA异常检出率[8]相当。

因此，不良孕产史孕妇如果无染色体异常高风险因素且胎儿无超声异常发现，其产前CMA检出率与无指征产前诊断孕妇相比并无明显增加，是否行产前CMA检测需要结合家属意愿进行综合评估，而并非一线推荐。

曾妊娠过染色体非整倍体胎儿的妇女再次妊娠时，通常认为胎儿染色体异常的风险增加，但这一结论源于上世纪80年代欧洲羊水穿刺的数据[11]。

2004年的一项研究认为这种风险增加可能与再孕时孕妇年龄增加有关，因为校正孕妇年龄后，既往有染色体三体妊娠史的妇女与没有染色体异常胎儿妊娠史的妇女相比，再孕时胎儿染色体三体的发生率并无增加（OR=1.3，95%CI：0.7~2.1）[12]。

本研究低风险组
中有14例21-三体患儿生育史和3例性染色体非整倍体患儿生育史，无一例胎儿CMA异常。

与21世纪初相比，对于常见的非整倍体，目前有更多灵敏度、特异度以及阳性预测值更高的筛查手段，因此对于这一组不良孕产史的妇女，再孕时是否将侵入性产前诊断作为一线检测方法，值得探索。

对于CMA分辨率以下的基因组变异，或者单个基因内部的缺失/重复、单碱基突变，CMA均无法检测，因此先证者为单基因突变时，应选择基因序列检测方法。

再发风险按孟德尔遗传定律计算，CMA可检测的CNVs风险应与人群风险相当。

3.总结：CMA具有其自身的局限性，不能检出平衡性的倒位、易位，不能检出分辨率以下的小片段改变，也不能检出单碱基突变等[3,10]。

因此，在应用CMA对不良孕产史孕妇进行产前诊断前，明确“不良孕产史”的病因，即先证者的致病原因，是合理应用CMA进行产前诊断的关键。

从本研究看，单基因病、原因不明或先证者未发现CMA异常并非CMA的适应证。

在染色体非整倍体筛查技术进一步发展的情况下，染色体异常患儿妊娠史或生育史妇女再孕时是否建议行CMA 检测也值得进一步讨论。