细胞周期检查点的分子机制 吴家睿

《生物工程进展》1999,V ol.19,No.4

细胞周期检查点的分子机制

吴家睿

(中国科学院上海生物化学研究所　上海　200031)

摘要　细胞在长期的进化过程中发展出了一套保证细胞周期中DNA复制和染色体分配质量的检查机制,通常被称为细胞周期检查点(checkpoint)。当细胞周期进程中出现异常事件,这类调节机制就被激活,及时地中断细胞周期的运行,待细胞修复或排除了故障后,细胞周期才能恢复运转。根据“质量控制”的内容,可将细胞周期检查点分为三种。第一种负责查看DNA有无损伤,称为DNA损伤检查点;第二种负责DNA复制的进度,称为DNA复制检查点;第三类是管理染色体的正确分配与否,称为纺锤体组装检查点。本文围绕检查点工作的这三个方面对其分子机制作一个简单的论述。

关键词　细胞周期　检查点　DN A复制　DNA损伤　染色体分配

细胞周期最主要的任务是将其基因组DNA在DNA合成期(S期)完整地复制成两份拷贝,然后在分裂期(M期)将这两份拷贝正确无误地分配给两个子代细胞。如果在这一任务的完成过程中产生的错误没有得到及时纠正,那么将导致基因组的不稳定和变异。对单细胞生物而言,其后果是导致细胞增殖能力下降或细胞死亡。对多细胞生物而言则通常是引起肿瘤。细胞在长期的进化过程中发展出了一套保证细胞周期中DNA复制和染色体分配质量的检查机制,通常被称为细胞周期检查点(check-point)。这是一类负反馈调节机制。当细胞周期进程中出现异常事件,如DNA损伤或DNA复制受阻,这类调节机制就被激活,及时地中断细胞周期的运行,待细胞修复或排除了故障后,细胞周期才能恢复运转。

根据“质量控制”的内容,可将细胞周期检查点分为三种。第一种负责查看DNA有无损伤,称为DNA损伤检查点(DNA dam ag e checkpo int);第二种负责DN A复制的进度,称为DNA复制检查点(DNA r eplication check-point);第三类是管理染色体的正确分配与否,称为纺锤体组装检查点(Spindle assemmbly checkpo int),因为染色体的分配主要依赖于纺锤体的作用。近几年来,在检查点如何工作的分子机制的研究方面已有了许多进展。本文试图围绕检查点工作的这三个方面作一个简单的论述。

1　DNA损伤检查点

检查点工作的第一步是发现问题。一般认为,DNA损伤的出现可以迅速地激活DNA损伤检查点。由于DNA损伤可以发生在细胞周期的任一个时期,包括G1期、S期、G2/M期中,且DNA损伤有许多种类,所以存在多种探测DNA损伤的手段。它们可以在不同的时期对特定的DNA损伤进行检测。在酵母细胞中, DNA链的断裂和单链DNA的形成可以产生损伤起始信号,由至少两类检查点蛋白进行感知。一类是Rad9;另一类是Rad24,Rad17, M ec3和Ddc1。最新的研究发现,Rad9蛋白在DNA损伤的情况下,被M ec1和T el1激酶磷酸化,然后与Rad53蛋白结合[1]。研究者通过双杂交和免疫共沉淀等方法揭示,Rad17,M ec3和Ddc1形成蛋白复合体,其功能受Rad24的调节,即位于Rad24的下游[2]。Rad24能与DNA复制的辅助蛋白RFC上的亚基Rfc2结合[3]。因此,Rad24可能与RFC形成探测器,一

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旦发现损伤,就将Rad17,Mec3和Ddc1复合体引到损伤的DNA上,并启动下游的检查点反应。哺乳动物细胞的DNA损伤探测方式现在并不清楚,但因为许多酵母检查点蛋白质都有其哺乳动物同源蛋白质,所以人们认为检查点的分子机制在进化过程中是很保守的。因此,哺乳动物细胞的DNA损伤探测器可能与酵母的相似。

蛋白质的磷酸化级联反应是细胞最主要的信号传导和控制机制。同样,细胞周期检查点也把蛋白质的磷酸化级联反应作为其信号传递的主要方式。Rad3蛋白是在裂殖酵母细胞中负责检查点工作的一种蛋白激酶。一旦DNA发生损伤,Rad3就能磷酸化下游的Chk1激酶,而Chk1又进一步磷酸化Cdc25磷酸酯酶[4,5]。在芽殖酵母中也存在类似的磷酸化途径。DNA的损伤可以导致Mec1蛋白激酶对Ddc1和Rad9的磷酸化[1,6]。磷酸化的Rad9可以结合在Rad53激酶的FHA2区域上,并磷酸化Rad53激酶,从而使Rad53可以磷酸化下游的效应分子[7]。

在哺乳动物细胞里,DNA损伤同样也是引起上游的蛋白激酶的激活和对下游分子的磷酸化。DNA依赖的蛋白激酶(DNA-PK)在DNA 损伤诱变剂的作用下可以对p53磷酸化,导致p53能够与DNA结合[8]。ATM是属磷脂酰肌醇(PI-3-K)激酶家族的成员(Rad3和DNA-PK也同属于PI-3-K家族),它是从AT病患者中得到的。这类患者的细胞对辐射高度敏感。研究表明其主要原因就是ATM基因在AT患者中发生了突变。如果用射线照射正常的淋巴细胞,将迅速增加ATM的激酶活性,并对p53的第15位丝氨酸进行磷酸化[9,10]。另外还有实验表明,ATM在DNA损伤或复制受阻时能对Chk2激酶磷酸化,而Chk2又可以对Cdc25进行磷酸化[11]。

磷酸化的信号传递方式不仅有可逆和响应快的优点,还可以使对蛋白质的调节更为精致和多样化。研究者发现,裂殖酵母的检查点蛋白Husl在DNA复制受阻时被磷酸化的蛋白质数量少于DNA损伤情况下的磷酸化蛋白质数量,表明Husl的磷酸化程度可能被用来区别DNA复制检查点和DNA损伤检查点[12]。另外有实验证明,检查点蛋白Rad53上含有两个FHA区域,磷酸化的Rad9只能结合在FHA2上。有可能Rad9在G1和G2期与Rad53的FHA2结合以启动这两个时期的DNA损伤检查点工作,而另外的蛋白激酶在磷酸化后与Rad53的FHA1结合以启动S期的DNA损伤检查点反应[13]。

一旦发现问题,检查点的首要任务就是中止细胞周期的运行。其主要方式是将细胞周期的引擎——CDK关闭。P21是CDK的一种蛋白质抑制物。过去的工作表明,在G1期DNA 损伤时,可以引起p53的积累和活化;p53则可以诱导p21的转录。p21蛋白结合在Cdk4/6或Cdk2上,造成G1期的休止[14]。最近又发现, p53和p21的活性对于维持G2期的休止也是必需的[15]。Cdc2负责驱动细胞进入M期。Cdc2的活性除了依赖于与CyclinB的结合,还需要Cdc25对Cdc2第15位酪氨酸的去磷酸化。当DNA损伤检查点开动后,Chk1或Chk2激酶可以对Cdc25进行磷酸化[5,11]。磷酸化的Cdc25可以被一种14-3-3蛋白结合并转移至细胞质,使Cdc25不能发挥去除Cdc2磷酸基团的作用,从而保持Cdc2的失活状态,使细胞停止在G2期[16]。

2　DNA复制检查点

在检测DNA复制的完成情况时,常常是通过参与DNA复制的蛋白质来进行。有实验表明,DNA合成酶Pol 和复制因子RFC的亚基Rfc5就负有探测的功能[17,18]。在裂殖酵母中,Rad12编码一种解旋酶(helicase)。它能对DNA复制的抑制作出反应,并通过调节其下游的Rad9而开启检查点机器[19]。值得注意的是,这些蛋白因子既对DNA复制抑制有反应,也能对DNA损伤进行检测。表明细胞周期检查点对这两类问题的探测是密切相关的。

DNA复制检查点的机理研究发现,其工作

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