碳青霉烯酶在碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯杆菌的分布及分子流行病学

基金项目：温州市科技计划项目（Y20140035）

作者简介：王建友（1973-），男，主管技师，从事细菌耐药性方面研究，Email：wangjianyouyq@ 通讯作者：王建友·论著·

碳青霉烯酶在碳青霉烯类耐药

肺炎克雷伯杆菌的分布及分子流行病学

王建友1，周阿旺2，陈丹1

1．检验科；2．呼吸内科，乐清市第二人民医院，浙江乐清325608

摘要：目的了解碳青霉烯酶在碳青霉烯类抗生素耐药肺炎克雷伯杆菌的分布及其分子流行病学。方法收集我院2010年1月至2012年12月分离的碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯杆菌120株，采用改良Hodge 试验及EDTA协同试验进行碳青霉烯酶表型的确认，用PCR方法扩增碳青霉烯酶基因（KPC、IMP、NDM、VIM、OXA-48），经电泳检测扩增产物后纯化测序。通过MLST及ERIC-PCR进行分子流行病学分析。结果120株碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯杆菌中，95株CRKP菌株改良Hodge试验阳性，64株菌株EDTA协同试验阳性。经PCR及测序确认，83株主要携带KPC-2型碳青霉烯酶，占69.2%；其次为IMP-4型金属酶，占28.3%（34/120），NDM-1型金属酶15株，占12.5%，未发现VIM和OXA-48碳青霉烯酶。ERIC-PCR及MLST分型显示出20个基因分型，其中ST395-A型和ST11-B型主要流行于产KPC-2型菌株中，占43.88%；ST263-B型和ST15-C型主要流行于产NDM-1菌株中，占13.27%；而ST11-B型主要分布于产IMP-4和KPC-2菌株中，占24.49%。结论我院碳青霉烯酶耐药肺炎克雷伯杆菌存在多种碳青霉烯酶，主要以KPC-2为主，产不同种类碳青霉烯酶菌株存在不同的流行基因型。

关键词：碳青霉烯酶；流行病学；肺炎克雷伯杆菌

中图分类号：R378.996文献标志码：A文章编号：1005-376X（2015）05-0517-04

DOI编码：10.13381/ki.cjm.201505006

The distribution and molecular epidemiology of

carbapenemase in carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae

WANG Jian-you1，ZHOU A-wang2，CHEN Dan1

1.Department of Laboratory Medicine；

2.Department of Respiratory Medicine，

the Second People's Hospital of Yueqing，Yueqing325608，China

Corresponding author：WANG Jian-you，Email：wangjianyouyq@

Abstract：Objective To investigate the distribution and molecular epidemiology of carbapenemase in carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae in our hospital.Methods120strains of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoni-ae（CRKP）were collected from our hospital from Jan2010to December2012.The modified Hodge test and EDTA double-disc synergy test were used to detect the cabapenemase.PCR was used to amplify the carbapenemase genes （KPC，IMP，NDM，VIM and OXA-48），and all the PCR products were sequenced to be confirmed.The molecu-lar epidemiology analysis was done by MLST and ERIC-PCR.Results Among the120strains of CRKPs，95were positive by the modified Hodge test and64were positive by EDTA-synergism test.PCR and sequencing confirmed that83strains carried KPC-2carbapenemase，accounting for69.2%，followed by IMP-4enzyme，accounting for 28.3%（34/120）.In addition，there were15strains of NDM-1carbapenemase producers，accounting for 12.5%.The VIM and OXA-48carbapenemases were not found.There were15genotypes of carbapenemase-produ-cing Klebsiella pneumoniae showed by ERIC-PCR and MLST typing.Among them，the ST395-A type and ST11-B type are prevalent in KPC-2-producing strains，accounting for43.88%；ST263-B type and ST15-C type were pre-

dominant in NDM-1-producing strains，accounting for13.27%；ST11-B type mainly distributed in the strains pro-ducing both IMP-4and KPC-2，accounting for24.49%.Conclusion There are several carbapenemase types prev-alent in the carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae strains in our hospital.The resistance is mainly mediated by the blaKPC-2gene.There are several prevalent genotypes existed in the strains producing different types of car-bapenemase.

Key words：Carbapenemase；Epidemiology；Klebsiella pneumoniae

肺炎克雷伯杆菌是目前临床最常见的院内感染致病菌之一［1］，由于人口流动的增多，临床多重耐药肺炎克雷伯杆菌甚至“超级细菌”正在以惊人的速度流行全球［2］。碳青霉烯类抗生素作为治疗产ESBL及多重耐药肺炎克雷伯杆菌感染的首选药物而受到临床治疗的广泛欢迎，同时也给临床耐药带来了严重的问题。近年来，碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯杆菌的比例逐年上升，而产碳青霉烯酶是导致其广泛播散的主要原因。碳青霉烯酶可广泛水解包括碳青霉烯类抗生素在内的所有β-内酰胺类抗生素，且可携带在质粒上而导致大范围的流行［3］。因此深入了解我院碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯杆菌中碳青霉烯酶的分布情况及其分子流行病学特征，有助于合理指导临床抗生素的使用，同时指导及时有效的控制其流行。

1材料与方法1.1标本和菌株来源收集我院2010年1月至2012年12月分离的碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯杆菌120株。菌株主要分离自痰液55株，其次为尿液33株，血液27株，引流液5株。经Vitek2compact 全自动微生物鉴定药敏分析仪鉴定及药敏试验。试验操作及结果判读严格按照CLSI2013年版进行。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922和肺炎克雷伯杆菌ATCC700603（由本室保存）。

1.2仪器Vitek2compact全自动微生物鉴定药敏分析仪（法国生物梅里埃公司）、PCR仪（德国Eppen-dorf公司产品）、电泳仪（美国BIO.RAD公司）；凝胶成像系统（上海天能公司）。

1.3试剂与引物PCR试剂和DNA Marker I购于TaKaRa大连宝生物公司，引物设计参照文献，PCR 扩增产物纯化后送上海生工生物技术有限公司测序，见表1。

表1PCR引物序列

引物序列长度（bp）文献KPC F5'-GTATCGCCGTCTAGTTCTGC-3'638［4］R5'-GGTCGTGTTTCCCTTTAGCC-3'

IMP F5'-TGAGCAAGTTATCTGTATTC-3'740［4］R5'-TTAGTTGCTTGGTTTTGATG-3'

VIM F5'-TTATGGAGCAGCAACCGATGT-3'920［4］R5'-CAAAAGTCCCGCTCCAACGA-3'

NDM-1F5'-GGTTTGGCGATCTGGTTTTC-3'621［4］R5'-CGGAATGGCTCATCACGATC-3'

OXA-48F5'-TTGGTGGCATCGATTATCGG-3'743［4］R5'-GAGCACTTCTTTTGTGATGGC-3'

1.4改良Hodge试验和EDTA协同试验参照参考文献［4］进行。

1.5PCR扩增碳青霉烯酶基因采用煮沸法提取肺炎克雷伯杆菌基因组DNA，参照相关文献及PCR 体系进行PCR操作［5］，采用琼脂糖凝胶电泳对PCR 产物进行电泳，纯化PCR产物送测序公司测序，并进行BLAST序列比对。

1.6MLST分型参照网站http：//www.pasteur.fr/ recherche/genopole/PF8/mlst/Kpneumoniae.html，设计7对管家基因的引物（gapA-infB-mdh-pgi-phoE-rpoB-tonB），参照文献［6］进行PCR反应体系及设置参数，并将PCR阳性产物送至上海生工生物有限公司进行双向测序，序列结果在MLST网站上比对查询，每一个管家基因都得到一个亚型。7个管家基因得到7个亚型，然后经组合比对就得到一个序列型ST。

1.7ERIC-PCR参照文献［7］使用ERIC-2引物3'-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-5'对hvKP菌的同源