01第一章_生物大分子物质的制备.ppt.Convertor

第一章生命大分子物质的制备

第一节材料的选择与处理

第二节确立测定方法

第三节细胞的破碎

第四节抽提

第五节浓缩

第六节纯化方案的设计与评价

第七节有效成分纯度和性质的分析

第八节应用实例

生命大分子物质通常是指：

动物、植物和微生物在进行新陈代谢时所产生的蛋白质(包括酶)和核酸等有机化合物的总称。

生命科学研究将进入后基因组时代。分离纯化和测试分析蛋白质技术显得十分重要。

本章将以蛋白质和核酸为主线讨论其制备的一般过程，即材料的选择与处理、测定方法的确立、有效成分的抽提、粗品的纯化和纯品的鉴定(这部分移至后面的章节介绍)等步骤。

第一节材料的选择与处理

一、材料的选择

A.有效成分

是指欲纯化的某种单一的生命大分子物质。而有效成分以外的其他物质则统称杂质。

B.有效成分在材料中存在的特点

有效成分的含量一般较少

如胰脏中胰岛素的含量小于其鲜重的百万分之一。

有效成分稳定性较差

大多数对酸、碱、高温和高浓度有机溶剂等因子较敏感，易被微生物分解变质。

选用的材料不同，有效成分的含量就不同；

选用的材料即使相同，但是部位或生长期不同，有效成分的含量也不尽相同。

C.材料选择应遵循的原则

有效成分含量多、稳定性好

来源丰富、保持新鲜

提取工艺简单

有综合利用价值等

二、材料的处理

选择到合适的材料后，应及时使用，或采用冰冻或干燥等方法处理。同时还应将易于去掉的非需物质除去。

1 动物脏器

(1)冰冻

应在很短时间内置-10℃冰库(可短期保存)或-70℃低温冰箱(数月不变质)贮存。

脱脂

脂肪容易氧化酸败，导致原料变质，而且还会影响纯化操作和制品得率。

一般脱脂的方法有：

A.人工剥去脏器外的脂肪组织；

B.浸泡在脂溶性的有机溶剂(如丙酮、乙醚)中脱脂；

C.采用快速加热(50℃左右)、快速冷却的方法，使熔化的油滴冷却后凝聚成油块而被除去；

D.利用油脂分离器使油脂与水溶液得以分离。

(2)干燥

A.丙酮液中脱水，干燥后磨粉贮存备用；

B.在沸水中蒸煮处理，烘干后能长期保存。

2 植物组织

A.叶片

用水洗净即可使用；

或在l0h内置-4～-30℃冰箱贮藏备用。

B.植物种子

需泡胀或粉碎才可使用。

材料含油脂较多时，要进行脱脂处理。

3 微生物

为制备生命大分子物质的主要材料之一。

用离心法收集到的上清液，

可用于制备胞外酶和某些辅基等有效成分；

可置低温下短时间贮存。

收集到的菌体，经破细胞处理后则可从中提取其他有效成分；或制成冻干粉，在4℃保存(数月不会变质)。

第二节确立测定方法

一、目的与要求

测定哪些材料含有目标有效成分

哪些材料含量丰富

提纯过程纯度是否逐渐增加

要确立专一、准确、灵敏和简便的测定方法。

因为：有效成分在原材料中含量较低；底物要专一性的。

二、常用的测定方法

1.光谱法

2.电化学法

3.生物活性检测法

4.免疫分析法

5.生物传感器

1 光谱法

(1)吸收光谱法[①直接测定法；②比色法]

(2)荧光法

(3)浊度法

特点：

测定时所需的样品量较少，但往往能产生比较高的消光值；

且操作简单，反应迅速、灵敏；

结果也较准确，

(1)吸收光谱法

直接测定法、比色法

①直接测定法

将待测物(如核酸、蛋白质)配制成一定浓度的溶液后，移至相应波长的分光光度计中，

即可从测定的消光值换算出待测物的含量。

A.测定核酸含量

构成核酸的碱基组分是分光光度计测定核酸含量的依据。

在测定过程中，DNA或RNA溶液浓度的增加或降低，会使其在波长260nm的消光值(A260) 随之增加或降低，二者之间成正比关系。通常1个A260值分别相当于

双链DNA 50µg／ml

单链DNA 37µg／ml

单链RNA 40µg／ml

用A260／A280比值可确定DNA和RNA的纯度：

纯DNA比值为

纯RNA的比值为

当此比值分别小于和时，表明样品中已污染了蛋白质或酚类等物质。

B.测定蛋白质的含量及纯度

蛋白质(包括酶和肽)溶液的A280值主要是由构成蛋白质组分的色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)的消光值决定的，胱氨酸的贡献很小。

②比色法

将待测物(如蛋白质、核酸、糖类)与相关试剂(见表1-2)或酶的底物作用后，根据呈现的颜色或形成的产物特性，移至相应波长的分光光计中，即可从测定的消光值换算出待测物的含量。

例如：

邻苯二酚(在275nm有吸收峰)

+ 邻苯二酚-2,3-双加氧酶

黄色的α- 羟基粘康酸半醛(在375nm有吸收峰)

通过检测375nm消光值的升高即可换算出所用酶的活力。

还可用不同消光值之间的比值鉴定某些物质的纯度

例如

纯细胞色素c还原型A550／氧化型A280比值为~ 。

假如比值过高或过低，就表明细胞色素C中污染了杂质。

(2)荧光法

特点：

荧光法的精确性、重复性和灵敏度比吸收光谱法好。

当分析物含量低、用吸收光谱法不能检测时，改用荧光法却能求得满意结果。

如：

NAD(菸酰胺腺嘌呤二核苷酸)（辅酶Ⅰ）

NADP(菸酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)（辅酶Ⅱ）

由于NADH2和NADPH2发荧光，用于偶联NADH2 (或NADPH2)的氧化或NAD(或NADP)的还原反应系统进行荧光测定。

例子：

谷草转氨酶(GOT)活力测定

采用与苹果酸脱氢酶（MDH)相偶联反应进行。

天冬氨酸+α- 酮戊二酸GOT 草酰乙酸+ 谷氨酸草酰乙酸+ NADH+H+ MDH L - 苹果酸+NAD+

每生成1分子草酰乙酸就消耗1分子NADH，这样GOT活力就可通过测定NADH在340nm消光值的下降来求得。