金线莲与内生真菌共生培养体系的建立_于雪梅

表 1 培养 60 d 时不同培养基上 2 种真菌
对金线莲生长的影响
cm
培养基
未接菌苗 增高
A

1 .958
B
3 .550
C
1 .817
D
1 .600
E
1 .883
注 :n =3
接 94017 菌苗 增高
1 .150 2 .100 1 .442 0 .900 2 .550
接 94005 菌苗 增高
虽然 A , B 培养基上未接菌的苗增高高于 E 培 养基上接菌苗增高 , 因本实验主要目的是筛选适合 菌-苗共生的最佳培养基 , 而 A , B 培养基并不适合菌 -苗建立共生关系 。 综合上述现象 , 初选 E 培养基为 共生培养基 。 3 .2 A , B , C , D 培养基上接种真菌对苗影响较大 , 可能由于 A 培养基糖浓度过高 , 造成真菌严重侵染 植株 。B , D 培养基缺乏有机成分和蔗糖两大重要成
1 .083 1 .600 1 .708 0 .475 2 .100
由表 1 可见 , A , B , C , D 4 种培养基上接种真菌 的苗增高均低于未接种真菌的苗增高 。E 培养基上 接种 94017 真的苗增高为 2 .1 cm , 高于未接种真菌 的苗增高(1 .883 cm)。
在 5 种培养基上 , 接种真菌的金线莲苗增高最 高为 E , 高于其它 4 种培养基 。 未接种真菌的金线 莲苗培养 60 d 时 B 增高最高(3 .55 cm), 其余依次 为 A(1 .95 8cm ), E(1 .883 cm ), C(1 .8 17 cm ), D(1 .600 cm)。 2 .3 接菌后金线莲组织学观察
第 25 卷第 2 期 2000 年 2 月
中 国
China Journal of
中药杂志
Chinese Materia
Medica
V
ol .25 , N o .2 Feb ., 2000
金线莲与内生真菌共生培养体系的建立
于雪梅 , 郭顺星
(中国医学科学院 中国协和医科大学 药用植物研究所 , 北京 100094)
[ 摘要] 目的 :建立金线莲与内生真菌共生培养 体系 , 为研究 内生真 菌促进 金线莲 生长机理 及金线 莲栽培 新 方法奠定基础 。 方法 :在金线莲组培苗基础上 , 将金线莲苗与真菌共培养 , 定期观察记录金 线莲苗与 真菌的生长 状 态 , 根据菌-苗共生特点筛选适合金线莲与内生真 菌共生的培养条件 。 结 果 :建 立了金线莲 与内生真 菌的共生培 养 体系 。最适共 生培养基为(mg·L -1):NH4N O3 825 , K NO 3 950 , M gSO4 185, 肌醇 100 , 其它有机成分为 M S 培养基 有 机成 分量的 2/ 3, 蔗糖 15 g·L -1 , 其它成分同 M S 培养基 , 琼脂 9 g·L -1 , pH 5.8 。 培养条件为 培养温度 24 ～ 25 ℃, 光照 150 lx , 光 照时间 11 h。 结论 :在此共生培养体系中金线莲苗与所筛 选出的优良 菌种可形 成内生菌根 , 并可 长 期共生 , 且真菌有促进金线莲生长发育作用 。
· 81 ·
第 25 卷第 2 期 2000 年 2 月
中 国
China Journal of
中药杂志
Chinese Materia
Medica
V
ol .25 , N o .2 Feb ., 2000
在 5 种 培 养基 上 , 94017 真 菌 生 长 速度 都 较 94005 真菌快 , 这是由真菌自身特性决定的 。 在 M S 培养基上 , 两种真菌生长较快 , 94017 菌接种 10d 即 侵染到植株下部茎 1 cm 处 。 94005 菌接种 15 ～ 20 d 与苗相接触 。培养 25 ～ 30 d 时 , 接种 94017 菌的苗 基部出出褐色分泌物 , 接种 94005 菌的苗有的下部 变黑 。 培养 60 d 时未接 种真菌苗平均增高显著高 于接种真菌的苗增高 。 在 B , C 培养基上 , 94017 菌 与苗共培养 25 ～ 30 d 时菌才基本与苗相接触 , 继续 培养 时 , 两 种菌 的 生 长 速 度 减 慢 , 培 养 60 d 时 , 94005 菌还未与金线 莲的根完全接触 , 根 仍然呈绿 色 。 在 D 培养基上 , 两种真菌几乎不能生长 , 苗后期 变成黄褐色 。 金线莲苗细弱 , 且生长速度缓慢 。 在 E 培养基上 , 培养 25 ～ 30 d 时 , 两种菌与苗相接触 , 培养 60 d 时 , 两种菌都已与金线 莲的根完全接触 , 即菌丝包围在根周围 , 根呈浅黄褐色 。 在整个培养 过程中 , 植株长势健壮 。 继续将两者共培养 6 个月 , 两者仍保持共生状态 。 2 .2 不同培养基上真菌对金线莲的影响(表 1)
第 25 卷第 2 期 2000 年 2 月
中 国
China Journal of
中药杂志
Chinese Materia
Medica
V
ol .25 , N o .2 Feb ., 2000
分 , 加之菌竞争营养 , 对植株生长有较大影响 。 E 培 养基适合菌苗共生 , 二者在其上可交换营养物质 , 因 此菌促进苗生长 。C 培养基上接菌与不接菌对苗影 响不如 A , B , D , E 培养基明显 , 可能微量元素不是菌 -苗共培养时的主要制约因素 。 3 .4 本实验筛选出的共生培养体系验证了 Hadley (1974), Dijk(1995)[ 2] , Bey rie(1995)[ 3] 等实验结果 , 即糖浓度低时有利于兰科植物与内生真菌共生 , 低 氮情况下内生真菌促进兰科植物生长 。这也是本实 验 E 培养基的设计依据 。现已将其应用于研究金线 莲与内生真菌的关系中 。 虽然本实验筛选出的共生 培养体系适合兰科植物与内生真菌共生 , 并保持二 者的共生平衡关系 , 但是 , 兰科植物菌根中真菌同寄 主之间共生平衡关系也是有条件的 , 一旦环境条件
[ 收稿日期] 1999-06-18 [ 资助项目] 国家自然科学基金资助项目(39970018)
芽转入 MS 培养基中成苗 , 1 ～ 2 个月后 , 苗高 2 ～ 4 cm , 根长 0 .5 ～ 1 .5 cm 。 1 .2 .2 菌种培养 :将真菌接种到平皿麦麸培养基上 培养 7 ～ 10 d 。 1 .2 .3 供试培养基 :A.MS 培养基 ;B.MS 培养基 , 无有机成分 ;C.MS 培 养基 , 无微量元 素 ;D.M S 培 养基 , 无 蔗糖 ;E.NH4N O3 825 mg·L -1 , K N O3 950 mg·L -1 , MgSO4 185 mg·L -1 , 肌醇 100 mg·L -1 , 其 它有机成分为 MS 培养基 有机成分量的 2/ 3 , 蔗糖 15 g·L -1 , 其它 成分同 M S 培养基 , 琼脂 9 g·L -1 , pH 5.8[ 2 ～ 4] 。 1 .2 .4 共生培养条件的筛选 :将金线莲无菌苗垂直 插入 5 种供试培养基中 , 每 100 ml 三角瓶中 2 株幼 苗 , 两苗相距 1 ～ 1 .5 cm , 培养 10 ～ 15 d 时 , 将经麦 麸培养基活化的 94017 , 94005 两种真菌分别用打孔 器(直径 0 .45 cm)在菌落表面打取 平板菌块 , 然后
[ 关键词] 共生体系 ;金线莲 ;内生真菌
兰科植物中有许多名贵花卉和珍稀药用植物 , 并 且 在 自 然 条 件 下 大 都 与 真 菌 共 生 。金 线 莲 Anoectochi lus roxburghii (Wall .)Lindl 为兰科 花叶 开唇兰属植物 , 为名贵中草药 , 具有清热凉血 、祛风 利湿 、强心 、固肾 、利尿 、平肝 、降血压等功效 。 近年 来主要用于治疗高血压 、糖尿病及肿瘤等疑难病症 , 引起医药界的广泛重视 。 民间称其为“神药”[ 1] 。 由 于该植物自然生态条件独特 , 繁殖率低 , 生长缓慢 , 加上鸟类嗜食 , 特别是近年来对其需求量猛增 , 产区 人们过度采挖 , 使得金线莲野生资源日渐枯竭 。 在 野生金线莲的根中 , 我们已观察到内生真菌的存在 。 因此 , 建立金线莲与内生真菌共生培养体系 , 筛选促 进金线莲生长的优良共生菌种 , 进而研究金线莲与 内生真菌的关系 , 对保护金线莲的种质资源 , 研究其 新的栽培繁殖方法具有较大理论意义和应用价值 。 1 实验材料与方法 1.1 实验材料
用接种针将一平板菌块接种于与两苗相距 3 cm 培 养基上 , 并稍将菌块按入培养基中 。 每种培养基均 设对照(即只接 苗不接种 真菌)。 每 一处理 重复 3 瓶 。培养温度 24 ～ 25 ℃, 光照 150 lx , 光照时间 11 h 。 定期观察记录金线莲苗与真菌的生长状态 。 1 .2 .5 接 菌后金线莲组织学观察 :将苗从瓶中取 出 , 洗去培养基 , 切取根段 3 ～ 5 cm 固定于 FAA 液 中 。 常规石蜡包埋与切片 , 片厚 15 μm , 番红固绿染 色 , 光学显微镜观察 。 2 结果和分析 2 .1 不同培养基上菌-苗生长状态
在菌-苗共培养的前期约 25 ～ 30 d 时 , 94017 菌 对在 MS 和 B 培养基上的金线莲根几乎侵染至全部
· 82 ·
皮层细 胞 , 而 94005 菌仅侵染根 的部分表皮 细胞 。 但在 E 培 养基上 菌苗 培养的 后期 60 d 时 94017 , 94005 两菌均以菌丝结形式定殖于金线莲根表皮细 胞及少数在皮层最外一层细胞内 , 表皮细胞分布有 大量的菌丝 , 并可见菌丝碎段 。表皮细胞壁及皮层 最外一层细胞壁明显加厚 , 被番红染成红色 , 皮层最 外一层细胞除被菌丝定殖的细胞外 , 其余多中空 , 无 细胞质及细胞核 。皮层及维管组织部分细胞的核明 显膨大 。 接种 94005 菌的金 线莲根 在真菌未 侵入 时 , 维管组织周围的皮层细胞内有多糖颗粒累积在 核周围 , 真菌侵入后多糖颗粒减少 , 变为脂肪类物质 累积在核周围 。 接种 94017 菌的根细胞内多糖颗粒 在菌丝侵入前后均较接种 94005 菌的多 。 3 讨论与小结 3 .1 共生培养基的筛选 , 在不同培养基上 , 金线莲 苗与真菌生长状态不同 。 真菌对金线莲苗生长的影 响也不同 。 在全营养的 MS 培养基中菌过于旺盛生 长 , 与苗竞争营养成分和空间 , 并将植物的根全部侵 染 , 影响了苗的生长 。 在缺乏一类营养物质的 B , C 培养基上 , 94005 菌一直未侵染 至根内 , 根 呈绿色 。 通常兰科植物 菌根呈浅黄褐 色 、浅 黄色或乳 白色 。 说明菌与植物根未形成菌根 , 菌与植物未建立共生 关系 , 二者仍是竞争关系 。从表 1 可看出在 B , C 培 养基上接种真菌均不利于植株生长 。在 D 培养基上 菌-苗均不能很好生长 。 说明蔗糖作为碳源是菌与 苗生长必不可少的条件 。 E 培养基 上菌-苗都能很 好生长 , 且真菌促进苗生长 , 二者可长期共存 。 真菌 以菌丝结形式定殖于根表皮细胞及少数皮层最外一 层细胞内 , 植株根浅黄褐色 , 为兰科植物菌根特征 , 说明两种菌均与植物建立了共生关系 , 形成了菌根 。 另外 , 一般认为内生真菌不但可促进植物生长 , 同时 还可防止植物致病菌对其污染 , 因为这些真菌常可 产生抗生素类物质 , 为植物生长创造一个良好微环 境[ 5] 。
植物材料为 金线莲 A .roxburghii 无 菌苗 。 真 菌为分离自兰科植物的内生真菌 , 即解剖发现根细 胞内存 在真菌菌 丝 。 其中 94017 真菌 分离自 金线 莲 , 94005 真 菌 分离 自铁 皮石 斛 Dendrobi um candidum Wall .ex Lindl 。 1 .2 方法 1 .2 .1 植物培养 :用金线莲茎段 、茎尖诱导出芽 , 将