血清中盐酸二甲双胍含量测定方法的建立和考核

血清中盐酸二甲双胍含量测定方法的建立和考核

前言

盐酸二甲双胍(metformin hydrochloride)是属于双胍类降血糖药物，该药在临床上使用多年，有很好的安全性和有效性。临床上主要用于II型糖尿病患者的治疗。本药可以单独使用或与磺脲类药物联合使用。

本文参考文献报道的方法，并对测定方法进行了改进，改进后的方法样品处理更简单，在保持精密度和准确度的情况下，所建立的方法在灵敏度方面也能够满足药代动力学研究的要求。

材料和方法

1．药品和仪器

1．1药品和试剂

标准品：盐酸二甲双胍，北京德众万全药物技术开发有限公司提供，含量99.7％。

试剂：乙腈为美国Fisher产色谱纯乙腈，所用的其它试剂均为分析纯，试验中各种溶液的配制均使用双蒸馏水。试验中使用的空白血清为购自北京红十字会血站。

1.2仪器和色谱条件

Agilent 1100液相色谱仪系统，由单元泵、自动进样器、紫外检测器、色谱工作站组成，以上各部分均由美国Agilent公司生产。

色谱条件为：Alltima sillica色谱柱(150mm×4.6mm 5μm)；流动相为乙腈：pH7.0 0.05mol/L磷酸盐缓冲液=40：60；流速为1ml/L；检测波长为233nm；柱温为室温；进样量为40μl。

1.3贮备液的制备

盐酸二甲双胍贮备液：称取适量的盐酸二甲双胍细粉于容量瓶中，用水溶解并稀释成50μg/ml的溶液作为贮备液，于冰箱中保存。

1.4血样处理方法

精密量取0.25ml含有药物的血清，精密加入0.5ml乙腈(1:2)，振摇30秒后，4000r/min离心10min后，取出上清液，于自动进样器小瓶中直接进样分析。

1.5标准曲线和质控样的制备

用贮备液和空白血清以三倍稀释的方式制备2.54, 0.847, 0.282, 0.094, 0.031, 0.011μg/ml的盐酸二甲双胍标准曲线溶液。按照血样的处理方法进行试验，以盐酸二甲双胍的浓度对其峰面积进行线性回归。试验中使用的质控样品为 1.01, 0.20, 0.04 μg/ml，其配制通过贮备液和空白血清配制而成。质控样品按照0.25ml/支的量分装并与试验中取得的血样一同保存。

结果

1.方法的专属性

图1-5分别为空白血清、空白血清＋盐酸二甲双胍，和受试者服药后的图谱。

图1. 空白血清图

图2 空白血清＋盐酸二甲双胍图(Rt=5.0min为盐酸二甲双胍峰)

图3. 受试者给药后的高浓度图

图4 受试者给药后的中浓度图

图5 受试者给药后的低浓度图

2．线性范围和标准曲线

按照标准曲线制备项下的操作，测得盐酸二甲双胍在测定的浓度范围内(2.54~0.011μg/ml)，按照1/y2加权回归，得到很好的线性，r=0.9995, Y= 40.200C

＋0.283。在本试验中，可以准确测定的药物浓度是0.011μg/ml即11ng/ml。考虑

到一次口服500mg盐酸二甲双胍后，体内的药物浓度最高可以达到1.2 g/ml，因此11ng/ml的定量低限对进行盐酸二甲双胍的药代动力学研究已经足够。见表1和图6。

表1 加权线性回归数据

图6 盐酸二甲双胍血药浓度计算时的标准曲线

3回收率

在健康人血清中加入不同体积的盐酸二甲双胍标准溶液，制备高、中、低三种不同浓度的盐酸二甲双胍血样，用标准曲线中的样品处理方法进行处理，测得的峰面积用标准曲线进行浓度计算并与实际浓度比较，得到相对回收率的数据，见表2。将高、中、低盐酸二甲双胍血清样品按照标准曲线中的样品处理方法进行处理，与盐酸二甲双胍水溶液样品所得到得峰面积进行比较，得到绝对回收率的值，结果见表3。

4. 日内、日间变异系数：将盐酸二甲双胍的血清高、中、低浓度样品按照标准曲线中样品的处理方法进行处理和测定，求得日内和日间精密度的结果，见表4、5，可以看出所建立的分析方法能够满足生物利用度测试要求。

表5 日间精密度

5. 血样标本的稳定性

试验发现盐酸二甲双胍血样标本贮存、融化、提取期间比较稳定。样品在贮存期间以质控样显示的结果表明样品没有出现降解，血样品冻融3次含量没有下降，血样经过沉淀处理后，其上清液在放置24小时时含量没有变化。

6．血药浓度测定时的质量控制

正式测定前，先进行方法学考察，在方法学考核通过后，并在仪器完全稳定后才开始样品测试。除测试的样品外，还加入一定数量的质控样品以及线性样品，只有在所加入的质控标准样品的测定结果符合要求时（< 20％），所测定的数据才看作有效，以及进行随后的药代动力学计算。