动物细胞融合最终版
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❖ 2、将悬液移入离心管中，以800r/min离心7～8min，倾去上 清液，加入8～10ml Hanks液，再次悬浮细胞，离心洗涤一 次，倾去上清液后将离心管倒置与滤纸上，尽量流尽剩余液 体（这一步骤很重要，因为残留液体会改变PEG的浓度）。
❖ 3、用手指轻弹离心管底壁，使沉淀物松散，然后吸取制备 好的50%PEG0.4ml，在37℃水浴中，于90s内逐滴加入离心管 中，边加边振摇离心管，使之与细胞混匀，然后加入8～ 10ml Hanks 液，轻轻吸打混匀，在37℃水浴中静置5min 以 稀释PEG。离心弃去上清液后，加入2～3ml含小牛血清的 1640培养液，在37℃水浴中孵育30min。
说明 观察细胞融合 加热有利于细胞融合 使细胞分离 装离心液 制作盖玻片 制作盖玻片 吸取细胞液 加热PEG 加热PEG使其溶解
细胞融合过程图
五个阶段
❖ 两个细胞的膜相互接触，粘连。
❖ 相接的两细胞膜破口粘合形成细胞膜通道。
❖ 两细胞之间细胞质相遇，形成细胞质通道。
❖ 通道扩大，两细胞连成一体。
❖ 细胞合并完成，形成一个含有两个或多个核 的圆形细胞。
❖
（注：上述阶段可在不同时期观察）
五、融合率的计算：
❖ 融合率是指在显微镜视野内，已发生融合的
细胞，其细胞核的总数与视野内所有细胞（包 括已融合和未融合细胞）的细胞核总数之比。 对孵育30min时制备的临时装片计算融合率。 通常以百分数表示，进行多个视野测定值的平 均统计更加准确。
融合率=（融合的细胞核数 /总细胞核数） ×100%
六、实验试剂及材料
• 1、材料：HeLa细胞、CHO细胞、鸡红细胞。 • 2、试剂：聚乙二醇（PEG，MV=4000）
灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面
细胞膜被病毒颗粒穿通 细胞膜连接
细胞融合，形成杂种细胞 （细胞膜具有一定的流动性）
过程：
5、动物细胞融合技术的发展简史告诉我们： 科学技术是不断发展的。那么，实现动物 细胞融合有什么意义呢？
➢打破生殖隔离，使远缘杂交成为可能； ➢广泛应用于多个学科领域； ➢重要用途：制备单克隆抗体。
Hanks液、0.25%胰蛋白酶、RPNI1640培 养液（含10%灭活小牛血清和不含血清的两 种）、PBS、0.2%次甲基蓝染液。 • 3、仪器设备：显微镜、水浴箱、普通离心机、 高心管、载玻片、盖玻片、酒精灯、试管。
实验试剂表
名称
规格
用量
聚乙二醇 Hanks液 ０.２５％胰蛋白酶 RPNI1640培养液
来自百度文库
❖ 细胞融合的应用
搞科研
三、实验步骤
• （一）、50%PEG液的制备
• 根据实验需要，称取一定量的PEG （MV=4000）放入刻度离心管内，在酒 精灯焰上加热，使其溶化，冷却至50℃时， 加入等体积病预热的无血清1640液混匀， 置之37℃水浴箱中保温待用。
（二）、融合方法：
❖ 1、取肝素抗凝的弃血清鸡血0.1ml(本实验是进行同种细胞 融合）。
医学细胞生物学设计型实验
实验项目:动物细胞融合
2010级临床 姜俊
目录
• 1、实验目的 • 2、实验原理 • 3、实验步聚 • 4、实验预期结果 • 5、融合过程观察以及融合率的计算 • 6、实验试剂及材料 • 7、注意事项
一、实验目的
• 1、了解动物细胞的融合 • 2、熟悉PEG诱导细胞融合的方法 • 3、掌握动物细胞融合的基本原理及方法 • 4、培养学生自主设计实验发现问题和解决问题的
诱导细胞融合（ induced cell fusion） ：指在人 为诱导条件下所发生的细胞融合现象。
自发细胞融合（ spontaneous cell fusion)：
指在未施加任何条件的情况下所发生的细胞融 合现象。
体内细胞的自发融合:
可以在受精过程、个体内的肌管形成、胚胎着床、巨细 胞和破骨细胞的形成、肿瘤细胞的融合等过程中观察到。
人工合成形成的融合细胞有两类：
同核体
异核体
由同一亲本 细胞融合而来
由不同亲本 细胞融合而来
2、动物细胞融合基本原理：
与植物原生质体融合的基本原理相同，即细 胞膜的流动性
3、诱导方式
物理法： 电激、振动、离心 化学法：聚乙二醇（PEG） 生物法：灭活的病毒 例如：仙台病毒
4.生物法：灭活的病毒（丧失感染性、保留抗原结构）
０.５ｍｌ １０ｍｌ ６ｍｌ 适量
PBS
适量
０.２％甲基蓝染液
适量
说明
使细胞膜重排 洗涤细胞 使细胞分离成单个细胞 培养细胞
使细胞处于稳定环境.洗涤细 胞 染色
实验仪器、设备、器具表
名称 显微镜 水浴箱 普通离心机 离心管 载波片 盖玻片 吸管 试管 洒精灯
规格、型号 数量 6 1 1 2 21 21 4 3 1
能力 • 5、提高学生的实验技能及创新能力 • 6、督促学生学习实验方法，端正实验态度，培养
良好的实验习惯。
二、实验原理
（一）动物细胞融合 1.概念：
细胞融合（cell fusion）：由两个或多个细胞相互接 触后，其细胞膜发生分子重排，导致细胞合并、染色体 等遗传物质重组的过程称为细胞融合。分为细胞自发融 合和诱导细胞融合。
在37℃水浴中 加2-3ml含小牛 卵育3min 1640的培养液
齐去上清液
用0.2%次甲基蓝染色
观察
四、预期结果：
• （一）融合过程观察： • 分别于温育5min、10min、15min、
20min、30min取细胞悬液一滴制成临时 装片，以0.2%次甲基蓝染液染色，在显微 镜下观察细胞融合的不同阶段，通常可把 融合过程大致分为5个阶段：
再次悬浮细胞 加入8—10ml
将离心管倒置于滤纸上 离心洗涤一次 Hanks
倾去上清液 离心7—8min
手离 指心 轻管
弹
在37℃水浴
吸取50%PEG0.4m于9l0s内中逐滴入
加入7-8ml
Hanks
离心管
在37℃水浴中静置 5min稀释PEG
在5min 10min 20min 30min去悬液制片
实验操作流程
（一）50%PEG液的制备
取一定量PEG放 入刻度离心管内
在酒精灯火焰上 加热使其溶化
待降至50℃时
加入等体积并预热的 无血清1640液混匀
置于37 ℃水浴 箱中保温待用
（二）融合方法：
一瓶已长成Hela细胞 常规方法消化 或CHO细胞
制细胞悬液
将悬液移入 离心管中
800r/min
倾去上清液，
❖ 3、用手指轻弹离心管底壁，使沉淀物松散，然后吸取制备 好的50%PEG0.4ml，在37℃水浴中，于90s内逐滴加入离心管 中，边加边振摇离心管，使之与细胞混匀，然后加入8～ 10ml Hanks 液，轻轻吸打混匀，在37℃水浴中静置5min 以 稀释PEG。离心弃去上清液后，加入2～3ml含小牛血清的 1640培养液，在37℃水浴中孵育30min。
说明 观察细胞融合 加热有利于细胞融合 使细胞分离 装离心液 制作盖玻片 制作盖玻片 吸取细胞液 加热PEG 加热PEG使其溶解
细胞融合过程图
五个阶段
❖ 两个细胞的膜相互接触，粘连。
❖ 相接的两细胞膜破口粘合形成细胞膜通道。
❖ 两细胞之间细胞质相遇，形成细胞质通道。
❖ 通道扩大，两细胞连成一体。
❖ 细胞合并完成，形成一个含有两个或多个核 的圆形细胞。
❖
（注：上述阶段可在不同时期观察）
五、融合率的计算：
❖ 融合率是指在显微镜视野内，已发生融合的
细胞，其细胞核的总数与视野内所有细胞（包 括已融合和未融合细胞）的细胞核总数之比。 对孵育30min时制备的临时装片计算融合率。 通常以百分数表示，进行多个视野测定值的平 均统计更加准确。
融合率=（融合的细胞核数 /总细胞核数） ×100%
六、实验试剂及材料
• 1、材料：HeLa细胞、CHO细胞、鸡红细胞。 • 2、试剂：聚乙二醇（PEG，MV=4000）
灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面
细胞膜被病毒颗粒穿通 细胞膜连接
细胞融合，形成杂种细胞 （细胞膜具有一定的流动性）
过程：
5、动物细胞融合技术的发展简史告诉我们： 科学技术是不断发展的。那么，实现动物 细胞融合有什么意义呢？
➢打破生殖隔离，使远缘杂交成为可能； ➢广泛应用于多个学科领域； ➢重要用途：制备单克隆抗体。
Hanks液、0.25%胰蛋白酶、RPNI1640培 养液（含10%灭活小牛血清和不含血清的两 种）、PBS、0.2%次甲基蓝染液。 • 3、仪器设备：显微镜、水浴箱、普通离心机、 高心管、载玻片、盖玻片、酒精灯、试管。
实验试剂表
名称
规格
用量
聚乙二醇 Hanks液 ０.２５％胰蛋白酶 RPNI1640培养液
来自百度文库
❖ 细胞融合的应用
搞科研
三、实验步骤
• （一）、50%PEG液的制备
• 根据实验需要，称取一定量的PEG （MV=4000）放入刻度离心管内，在酒 精灯焰上加热，使其溶化，冷却至50℃时， 加入等体积病预热的无血清1640液混匀， 置之37℃水浴箱中保温待用。
（二）、融合方法：
❖ 1、取肝素抗凝的弃血清鸡血0.1ml(本实验是进行同种细胞 融合）。
医学细胞生物学设计型实验
实验项目:动物细胞融合
2010级临床 姜俊
目录
• 1、实验目的 • 2、实验原理 • 3、实验步聚 • 4、实验预期结果 • 5、融合过程观察以及融合率的计算 • 6、实验试剂及材料 • 7、注意事项
一、实验目的
• 1、了解动物细胞的融合 • 2、熟悉PEG诱导细胞融合的方法 • 3、掌握动物细胞融合的基本原理及方法 • 4、培养学生自主设计实验发现问题和解决问题的
诱导细胞融合（ induced cell fusion） ：指在人 为诱导条件下所发生的细胞融合现象。
自发细胞融合（ spontaneous cell fusion)：
指在未施加任何条件的情况下所发生的细胞融 合现象。
体内细胞的自发融合:
可以在受精过程、个体内的肌管形成、胚胎着床、巨细 胞和破骨细胞的形成、肿瘤细胞的融合等过程中观察到。
人工合成形成的融合细胞有两类：
同核体
异核体
由同一亲本 细胞融合而来
由不同亲本 细胞融合而来
2、动物细胞融合基本原理：
与植物原生质体融合的基本原理相同，即细 胞膜的流动性
3、诱导方式
物理法： 电激、振动、离心 化学法：聚乙二醇（PEG） 生物法：灭活的病毒 例如：仙台病毒
4.生物法：灭活的病毒（丧失感染性、保留抗原结构）
０.５ｍｌ １０ｍｌ ６ｍｌ 适量
PBS
适量
０.２％甲基蓝染液
适量
说明
使细胞膜重排 洗涤细胞 使细胞分离成单个细胞 培养细胞
使细胞处于稳定环境.洗涤细 胞 染色
实验仪器、设备、器具表
名称 显微镜 水浴箱 普通离心机 离心管 载波片 盖玻片 吸管 试管 洒精灯
规格、型号 数量 6 1 1 2 21 21 4 3 1
能力 • 5、提高学生的实验技能及创新能力 • 6、督促学生学习实验方法，端正实验态度，培养
良好的实验习惯。
二、实验原理
（一）动物细胞融合 1.概念：
细胞融合（cell fusion）：由两个或多个细胞相互接 触后，其细胞膜发生分子重排，导致细胞合并、染色体 等遗传物质重组的过程称为细胞融合。分为细胞自发融 合和诱导细胞融合。
在37℃水浴中 加2-3ml含小牛 卵育3min 1640的培养液
齐去上清液
用0.2%次甲基蓝染色
观察
四、预期结果：
• （一）融合过程观察： • 分别于温育5min、10min、15min、
20min、30min取细胞悬液一滴制成临时 装片，以0.2%次甲基蓝染液染色，在显微 镜下观察细胞融合的不同阶段，通常可把 融合过程大致分为5个阶段：
再次悬浮细胞 加入8—10ml
将离心管倒置于滤纸上 离心洗涤一次 Hanks
倾去上清液 离心7—8min
手离 指心 轻管
弹
在37℃水浴
吸取50%PEG0.4m于9l0s内中逐滴入
加入7-8ml
Hanks
离心管
在37℃水浴中静置 5min稀释PEG
在5min 10min 20min 30min去悬液制片
实验操作流程
（一）50%PEG液的制备
取一定量PEG放 入刻度离心管内
在酒精灯火焰上 加热使其溶化
待降至50℃时
加入等体积并预热的 无血清1640液混匀
置于37 ℃水浴 箱中保温待用
（二）融合方法：
一瓶已长成Hela细胞 常规方法消化 或CHO细胞
制细胞悬液
将悬液移入 离心管中
800r/min
倾去上清液，