发酵设计大全

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年产17吨青霉素发酵车间工艺设计

第一部分青霉素的发酵工艺

1．菌种

最早发现产生青霉素的原始菌种得英国科学家茀莱明分离的点青霉，合成能力低下，沉没培养时只能产生2U/mL，远远不能满足工业生产的要求。后来找到另一种生产能力较强且适合液体深层培养的产黄青霉菌种，并再经X射线、紫外线诱变处理，得到生产能力较高的菌种，生产能力可达1000一1500U/mL。顾名思义，产黄青霉容易产生大量的黄色素，且分离时不易除去，故再将此菌进一步诱变处理，使其产生黄色素的能力丧失后，才成为世界通用的生产菌种。现代分子生物学方法的发展，为青霉素菌种的改进提供了新的契机，结合基因工程技术和发酵工艺的改进，使当今世界青霉素工业发酵水平已达85000U/mL以上。

国内大多数生产厂都采用绿孢子丝状菌。细胞生长发育分为6期：Ⅰ－Ⅲ长菌丝为主；Ⅲ－Ⅴ合成产物为主；Ⅵ放罐。

青霉素生产中，菌种是活的灵魂，对菌种的保藏至关重要。国内生产厂家一般在真空干燥状态下保存其分生孢子。也可用甘油或乳糖溶液作悬浮剂，在一70℃冰箱或液氮中保存孢子悬浮液或营养菌丝体。由于分生孢子在保存过程中较营养菌丝体更易变异，故保存营养菌丝是青霉素生产菌种保存的首选。

2．青霉素发酵工艺流程、工艺要点及过程控制

（1）丝状菌三级发酵工艺流程

冷冻管（25°C，孢子培养，7天）——斜面母瓶（25°C，孢子培

养，7天）——大米孢子（26°C，种子培养56h,1:1.5vvm）——一级种

子培养液（27°C，种子培养，24h,1:1.5vvm）——二级种子培养液

（27~26°C,发酵,7天,1:0.95vvm）——发酵液。

种子制备阶段包括孢子培养和种子培养两个阶段。孢子培养以获得

丰富的孢子(斜面孢子和米孢子)为目的；种子培养以获得大量健壮的营

养菌丝体(种子罐培养)为目的。孢子和种子质量对青霉素的产量有直接

影响，必须对其生产过程的每一环节严格控制。

(2) 工艺要点

a 生产孢子的制备斜面孢子培养基：甘油、葡萄糖和蛋白胨。孢子培养基：大米或小米固体培养基，培养条件是在无菌条件下25℃培养7天。成熟的孢子进行真空干燥后，低温保存备用。

b 生产种子的制备青霉素生产种子常用二级种子罐培养。第一级种子罐接入孢子，接种量为每立方米培养基不少于200亿孢子。培养基组成为玉米浆、乳糖和葡萄糖等。培养条件为27±1℃培养40h 图2—2 青霉素生产一般流程图

左右，控制通气量为1：3m3/(m3?min)，搅拌转速为300~350r/min。一级种子培养温度高于青霉菌的生长和生产温度，主要是为了促进孢子的萌发。

二级种子培养时接入10%一级种子，以葡萄糖和玉米浆等为培养基，培养温度25±1℃，培养时间10~14h，通风比(1：1)~(1：5) m3/(m3?min)，搅拌转速为250~280r/min。

种子质量要求：菌丝稠密，菌丝结团很少，菌丝粗壮，有中小空胞。在最适生长条件下，达到对数生长期时菌丝体量的培增时间约为6~7h。菌种保存时间过长、上一级种子生长不良、原材料质量发生波动等，都将影响菌体生长速度，使倍增时间延长。在工业生产中，培养条件及原材料质量均应严格控制，以保持种子质量的稳定性。

c 发酵生产发酵以葡萄糖、花生饼粉、麸质水、尿素、硝酸铵、硫代硫酸钠、苯乙酰胺和碳酸钙为培养基。发酵阶段的工艺要求见表2一1。

对于分批发酵来说，这一过程又分为菌体生长和产物合成两个阶段。前一阶段菌丝体快速大量生长。由生长阶段转入产物合成阶段的必要条件是菌丝体的比生长速率降低到一个合适的水平，这可通过降低葡萄糖浓度的方法来间接控制。为了维持青霉素的持续合成能力，在合成阶段，需要维持菌丝体处于最低比生长

速率。在转入合成阶段时，菌丝浓度不宜过高，以确保生产期菌丝体浓度有继续增加的余地。

发酵时的接种量约为20%，发酵温度先期为26℃后期为24℃，通气量为1：(0.8~1.2) m3/(m3?min)，搅拌速度为150~200r/min。

表2一1 青霉素发酵的一般工艺要求

①标准状态下的空气流量。

发酵过程必须适当加糖，并补充氮、硫和前体。加糖时要控制好残糖量，前期和中期约控制在0.3~0.6%范围内，加入量主要决定于耗糖速度、pH值变化、菌丝量及培养液体积。

pH值控制：一般，前期60h内维持pH值6.8~7.2，以后稳定在6.5左右。部分菌种，例如产黄青霉绿色孢子，最适pH值则始终在6.4~6.5范围内，高于7.0或低于6.0则出现代谢异常，青霉素产量显著下降。

泡沫控制：前期泡沫主要是花生饼粉和麸质水引起的，在前期泡沫多的情况下，菌丝体需氧量也低，可通过间歇搅拌来控制；中期泡沫可通过加油(消泡剂)来控制，必要时可略为降低通气量，但搅拌必须开足，否则会影响菌体呼吸。发酵后期产泡沫的量一般很少，勿需特殊控制。

发酵时间应从三个方面考虑：累计产率(发酵累计总亿产量与发酵罐容积及发酵时间之比值)最高；单产成本(发酵过程的累计成本投入与累计总亿产量之比值)最低；发酵液质量最好(抗生素浓度高，降解产物少，残留基质少，菌丝自溶

少)。这三个方面在发酵过程中的变化往往不同，须根据生产全局综合考虑，进行适当折中。

（3）过程控制

影响青霉素发酵产率的因素包括温度、pH值、基质浓度、溶氧饱和度、菌丝浓度、菌丝生长速度、菌丝形态等等。在发酵过程中，要对这些因素严格控制在适当的范围内，才能获得理想的发酵产率。

a 碳源控制生产用青霉菌能够利用的碳源有乳糖、蔗糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、淀粉和天然油脂等，但各碳源对青霉素产量的影响不同，其中乳糖是合成青霉素最好的碳源，葡萄糖次之。在生产过程中，利用乳糖的成本较高，只能用退而求其次，选用葡萄糖，但必须严格控制其浓度。乳糖之所以是青霉素合成最好的碳源，主要是由于菌体进行乳糖的代谢速度与菌体的合成速度相适应，不会产生中间代谢产物的积累。葡萄糖则不同，由于属于快速利用的碳源，其代谢速度要比菌体的合成速度快，导致部分中间产物的积累，从而抑制青霉素合成酶的合成。在中前期，葡萄糖的最适浓度是0.3~0.6%，超过此范围，将严重抑制青霉素合成酶的合成，从而导致青霉素合成能力的下降。低于此范围，由于菌体营养不足，呼吸受阻，使菌体过早衰老甚至自溶，同样会导致青霉素产量的下降。目前，葡萄糖的在线检测还存在一定困难，必须取样后用廉-爱农法滴定分析。葡萄糖的控制不是根据其浓度进行控制的，而是根据pH值、溶氧或CO2释放率予以调节。

b 前体控制前体主要是指用来合成青霉素分子上含苯环基团的侧链的苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸等。青霉菌即可将前体直接结合到青霉素分子中，也可作为养料和能源利用，即氧化为二氧化碳和水。前体究竟通过哪个途径利用，主要取决于培养条件以及所用菌种的特性。早期采用的Q176菌株，将大部分前体(71%~94%)氧化消耗掉，只有2%~10%转化为青霉素。而现代工业生产所用的菌种，前体转化率为46%~90%，为了避免前体加入浓度过大而对菌体产生不利影响，除基础料中加入0.07%外，其余按需要同氮源一起补入。

前体对青霉菌的生长发育有毒性，其毒性大小取决于培养基的pH值和前体的浓度。苯乙酰胺在碱性时毒性较大，pH=8时即抑制菌体的生长；苯乙酸在酸性(pH5.5)时毒性较大，碱性时不抑制菌丝体生长；pH 在中性时苯乙酰胺的毒性大于苯乙酸。前体用量大于0.1%时(除苯氧乙酸外)，青霉素的生物合成均会下降，尤以苯乙酰胺更甚。一般认为发酵液中发酵液中前体的浓度始终维持在0.1%为宜。