土壤真菌的分离

土壤真菌的分离

实验目的：掌握从土壤中初步分离培养真菌的方法，从而获得真菌纯培养技能；了解基本接种技术。建立严格的无菌操作概念，掌握无菌操作技术。

实验原理：土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现有重要应用潜力的微生物的主要菌源。真菌在土壤中的数量仅次于细菌和放线菌，主要在有机质丰富、透气性好的偏酸性土壤中较多。分离土壤中的真菌并不难，但由于其菌落大，容易扩展，技术准确性较低。本实验采用加有链霉素（或氯霉素、庆大霉素）和孟加拉红的马丁氏培养基分离及计数土壤中的真菌。在此培养基上，放线菌和细菌被链霉素和孟加拉红所抑制，但大多数真菌能够生存，且其菌落受孟加拉红的抑制而较小，从而避免了某些真菌的扩散蔓延而带来的数量上的误差。

实验器材和材料：

（1）器材：台秤、电子秤、烧杯、试管、三角瓶、量筒、酒精灯、移液管、移液枪、1mL无菌吸管、无菌培养皿、接种环。（2）材料：新鲜土样、无菌水、马丁-孟加拉红培养基。

试验方法和步骤：

1.培养基的制备

（1）配方：葡萄糖10.0g 、蛋白胨 5.0g 、琼脂20g 、K2HPO4

1.0g、MgSO4·7Ｈ2O 0.5g 、1/3000孟加拉红水溶液100mL、

0.03℅链霉素稀释液100mL、自来水800mL。

（2）操作步骤：

1）用搪瓷杯量取自来水500mL置小铝锅中，在电炉上加热。

2）按配方分别称取各种药品，加入自来水中，边加边搅拌，然后量取100mL1/3000孟加拉红水溶液加入。

3）加入20g浸洗过的琼脂煮沸至溶化。

4）总体积定容至900mL，无需调节pH值。

5）趁热分装于18mm×180mm试管，每管15mL，塞好棉塞，贴好标签，装入小铁丝筐，并用旧报纸将棉塞部分包好。

6）高压蒸汽灭菌，121℃灭菌30min。

注意：

1）取国产链霉素1g/瓶，用无菌吸管吸入10mL无菌水溶解，得到10%链霉素溶液。取0.3mL该溶液定容于100mL灭菌容量瓶即可

得到0.03%链霉素溶液。

2）使用前，将上述培养基熔化冷却至55～60℃，按每10mL培养基加入1mL0.03%链霉素溶液，即可使每毫升培养基含30ug链

霉素。

2.土壤稀释液的制备

用“稀释平板计数法”中的方法进行，将土样稀释至10-5。

称取土样10g放入盛90mL无菌水的三角瓶中，振摇约20分钟，使土与水充分混合，将菌分散。在无菌操作条件下，用1mL无菌移液管吸取lmL10-1浓度的菌液于一管9mL无菌水中，将移液管吹洗三次，摇匀即为10-2浓度菌液。同样方法，依次稀释到10-5。

注意：在土壤稀释过程中，吸取不同梯度的菌液需换用不同的吸管。

3.平板分离

（1）倒平板

将加入链霉素溶液的马丁氏培养基倒平板（方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶，左手拿平皿并松动棉塞，用小指和无名指夹住拔出，试管（瓶）口在火焰上灭菌，然后左手将培养皿盖在火焰附近打开少许，迅速注入培养基约15mL左右，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布，平置于桌面上，待凝后即成平板）。

（2）涂布

将上述每种培养基的三个平板分别标上10-1、10-2、10-3三种稀释度，然后用三支1mL无菌吸管分别由10-1、10-2、10-3三管土壤稀释液中各吸取0.1mL对号放于已标好稀释度的平板中，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀。

4.恒温培养

将上述接种土壤悬液的平板倒置于28℃培养3-5d。

5.挑菌纯化

从长有单菌落的平板中选取典型的真菌菌落转接斜面，并同时制片作纯度检查，若不纯，应进一步挑取该菌落制成菌悬液进一步作稀释分离，直至获得纯培养体为止。

6. 计数

选择每皿出现10～100个菌落的平板，计算土壤真菌（包括酵母

菌）的含量。

选择好计数的稀释度后，即可统计在平板上长出的菌落数，统计结果按下式计算：

每g样品的菌数=同一稀释度几次重复的菌落平均数×10×稀释倍数

注意：同一稀释度各个重复的菌数相差不太悬殊。

这样求得的是每克原始土样中的活菌数，若要折算为每克干土的含菌数，还应将此数值除以干土在土样中所占的质量分数（烘干土的质量/原土样的质量）

注：土壤含水量的测定是将一定质量的土样在105～110℃下烘干至恒重，再称干重。

7. 菌种保存

将分离到的真菌转接到PDA斜面上培养，待长好后，置于冰籍中保存，必要时进行深入研究。

注意事项

1. 涂布法接种时一定要涂抹均匀，否则就会无法记数。

2. 接种后的培养皿应静置15分钟以上，然后倒置培养。