单克隆抗体的制备及应用课件
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以抗肿瘤为例：将针对某一肿瘤抗原的单克隆抗体与化疗药 物或放疗物质连接，利用单克隆抗体的导向作用，将药物或 放疗物质携带至靶器官，直接杀伤靶细胞，称为肿瘤导向治 疗。另外，将放射性标记物与单克隆抗体连接，注入患者体 内可进行放射免疫显像，协助肿瘤的诊断。
常见抗肿瘤细胞毒剂：化疗药物、细菌毒素、 植物毒素或放射性同位素等。 这不仅提高了抗体的疗效，也可降低细胞毒剂 对正常细胞的毒性反应。
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16
细胞内DNA的生物合利合成用成糖核途和苷氨酸径基，酸进
而合成DNA
主要生物 合成途径
叶酸拮抗物氨基蝶 呤可阻断主要途径
甲氨喋呤
补救途径
次黄嘌呤
HGPRT+ 次黄嘌呤 核苷酸
胸腺嘧啶 TK+
胸腺嘧啶
脱氧核苷酸
DNA
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17
• 小鼠HGPRT-骨髓瘤细胞（Sp2/0）
• 融合后的细胞在HAT选择培养基中结局
33
作为研究工作中的探针
利用单克隆抗体的特性可把它作为研究工作中的探针。此时， 可以从分子、细胞和器官的不同水平上，研究抗原物质的结 构与功能关系，进而可以从理论上阐明其机理。 例子：用荧光物质标记单抗作为探针，能快速地确定与其结 合的相应生物大分子在细胞中的位置和分布。
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34
增强抗原的免疫原性
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37
5 第五部分
展望
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38
展望
对异源性单抗进行改造及人源 性单抗的研制成为单抗的重要 研究方向
单克隆抗体的这些特性使 得它成为治疗学上的热点
最突出的问题是如何降低单抗的免 疫原性，单抗的异源性所引起的抗 体反应，不但降低了单抗的效价， 而且会给患者带来严重的后果。
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作为检验医学实验室的诊断试 剂，单克隆抗体以其特异性强、 纯度高、均一性好等优点，广 泛应用于酶联免疫吸附试验、 放射免疫分析、免疫组化和流 式细胞仪等技术。并且单克隆 抗体的应用，很大程度上促进
了商品化试剂盒的发展。
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36
农兽药快速检测
农兽药属于小分子物质，半抗原，无免疫原性，不 能刺激动物产生抗体，必须先将其制备成人工抗原， 以人工抗原免疫动物，使动物的免疫系统发生应答反 应，从而制备出对该农药具特异性的多或单克隆抗体 国外已制备多种农兽药单克隆抗体并应用于农药和兽 药残留的免疫分析。
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12
序目 前 常 用 的 免 疫 程
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13
细胞融合和选择性培养
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14
融合过程中，常采用聚乙二醇（PEG）作为融合诱导 剂。PEG促进细胞融合的机制可能是与临近细胞膜的水 分相结合使细胞间的水分被取代，降低细胞表面的极 性，导致脂质双分子层不稳定，引起细胞膜的融合 。
39
感谢大家 请对不足之处提宝贵意见！
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40
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32
作为免疫抑制剂
抗人T淋巴细胞单抗（McAb）作为一种新型免疫抑制剂，已 广泛应用于临床治疗自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反应， 其作用机理有赖于McAb的种类及其免疫学特性。 例子：对于同种骨髓移植的供体骨髓，在体外经抗T细胞单 抗加补体处理，能够减轻移植物抗宿主病的发生。
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液相中的抗体（或抗原），形成抗原抗体复合物， 然后改变条件，使抗原抗体复合物解离洗脱出纯化 的抗体（或抗原）。 • A蛋白-Sepharose CL 4B
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27
4 第四部分 单克隆抗体的应用
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28
单克隆抗体的应用
农兽药的快速检测 检验医学诊断试剂
作为亲和层系的配体
作为生物治疗的导向武器
单克隆抗体的制备及应用
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1
目录
1 单克隆抗体的简介 2 单克隆抗体技术发展经历 3 单克隆抗体的制备 4 单克隆抗体的应用 5 展望
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2
1 第一部分 单克隆抗体的简介
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3
单克隆抗体的简介
1975年分子生物学家G.J.F.克勒和C.米尔斯坦在自然杂交技 术的基础上，创建立杂交瘤技术。他们把可在体外培养和无 限增殖的骨髓瘤细胞与经抗原免疫后的纯系小鼠脾细胞融合， 形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞既具有瘤细胞易于在体外 无限增殖的特性，又具有脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性 抗体的特点。
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10
免疫动物的选择：一般的杂交瘤生产都选用BALB/c 小鼠或LOU/c大鼠作为免疫动物。但是，有时为了特 殊目的而需进行种间杂交，则可免疫其他动物。就小 鼠而言，初次免疫时以8-12周龄为宜，雌性鼠较便于 操作。
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11
免疫程序的确定：在设计免疫程序时，应考虑到抗原 的性质和纯度、抗原量、免疫途径、免疫次数与间隔 时间、佐剂的应用及动物对该抗原的应答能力等。没 有一个免疫程序能适用于各种抗原。
应用
作为免疫抑制剂
增强抗原的免疫原性
作为研究工作中的探针
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29
作为亲和层系的配体
单克隆抗体能与其相应的抗原特异性结合，因 而能能够从复杂系统中识别出单个成分。只要 得到针对某一成分的单克隆抗体，固定在层析 柱上，通过亲和层析，即可从复杂的混合物中 分离、纯化这一特定成分。
优点：与其他提取方法相比，具有简便、快速、 经济、产品活性高等优点。
血清 ｜ 50%饱和度硫酸胺
上清 （清蛋白）
沉淀（球蛋白） ｜ 33%饱和度硫酸胺
上清 拟球蛋白
沉淀 r球蛋白
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24
凝胶过滤法：干燥的凝胶颗粒吸水后形成了多孔胶粒，将蛋白 质溶液加在凝胶柱上进行洗脱时，大分子蛋白不能穿过凝胶网 孔进入。胶粒内，留在胶粒间隙的溶液中，随洗脱液最先流出， 小分子蛋白可穿过凝胶网孔进入胶粒内，受到凝胶的阻留，向 下移动较慢洗脱出来较慢，据此将不同大小的蛋白质分离出来。
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30
蛋白质提纯
先用待提纯蛋白质制成单抗，再将单抗固定在惰性固相 基 质上，制成层析柱。而后倒入混合液，当混合液流经单抗时， 相应的蛋白质与单抗特异性结合，杂质则随洗脱剂流走。再 用特殊的洗脱剂将蛋白质洗脱下来，则可将蛋白质提纯。
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在亲和层析中单克隆抗体 是主要的配体
31
作为生物治疗的导向武器
人源化单克隆抗体
人源化抗体就是指抗体的可变区部 分或抗体全部由人类抗体基因所编 码。人源化抗体可以大大减少异源 抗体对人类机体造成的免疫副反应。
其抗体的可变区和 嵌合性单克隆抗体是指同时具有人和恒鼠定的区来都是人源的， 源构成，通常是30%比70%。鼠源部去分除用免来疫原性和毒 结合抗原，人源部分用来诱导产生疗副效作。用。 。
嵌合性单克隆抗体 全人源单克隆抗体
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6
3 第三部分 单克隆抗体的制备
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7
单克隆抗的制备
11
动物免疫
2
细胞融合和选择性培养
3
杂交瘤细胞的筛选及克隆化
4
大量制备及纯化
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8
单克隆抗体制备的简易流程
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9
动物免疫
抗原制备：制备单克隆抗体的免疫抗原，从纯度上说 虽不要求很高，但高纯度的抗原使得到所需单抗的机 会增加，同时可以减轻筛选的工作量。因此，免疫抗 原是越纯越好，同时应根据所研究的抗原和实验室的 条件来决定。一般来说，免疫用的抗原只需初步提纯 甚至不提纯，但抗原中混杂物很多，特别是如果这些 混杂物的免疫原性较强时，则必须对抗原进行纯化。
将单抗制成佐剂加在疫苗里，则可减少疫苗接种时药物的用量和避免多次接种并 不能引起机体更好地产生免疫应答，从而减少疫苗接种的风险。佐剂的作用机理：
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
改变抗原的物理性状，可 使抗原物质缓慢地释放， 延长了抗原的作用时间
佐剂能刺激 吞噬细胞对 抗原的处理
可刺激致敏淋巴细 胞的分裂和浆细胞 产生抗体
改变抗体的产生类型以 及产生迟发型变态反应， 并使其增强
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20
有限稀释法
4
22
m
3
43
42
32
44
m
14 1
4
3
3
3 33
4 44
3 33
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21
大量制备及纯化
大量制备
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22
纯化方法
1、盐析 2、凝胶过滤 3、离子交换层析 4、亲和层析法
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23
盐析：用中性盐使蛋白质沉淀析出的方法为盐析。大量的盐加入到蛋白溶液中， 高浓度的盐离子有很强的水化力，可夺取蛋白质的水化层，使蛋白质胶粒失水发 生凝聚而沉淀析出。
这种杂交瘤，通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克 隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗原决 定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（ mAbs ），简 称单抗。
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4
2 第二部分 单克隆抗体技术的发展经历
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5
单克隆抗体技术发展经历
鼠源性单克隆抗体
鼠源性单克隆抗体是来源于 鼠蛋白，因此对于人体而言 是外来物从而易被抵抗。
注意：PEG 的分子量和浓度与融合效果相关，PEG 的分子量越大，浓度越高，其促融率也越高，但其粘 度和细胞的毒性也随之增大；浓度低于30％时，融合 率低。
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15
HAT选择性培养 1964年Littlefield首先发明了HAT (H—Hypoxanthine次黄 嘌呤，A—Aminopterin甲氨喋呤，T—Thymidine 胸腺嘧 啶核苷) 选择性培养。 HAT选择性培养基是根据次黄嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸 生物合成途径设计的。
+ Sp2/0
B
Sp2/0 Sp2/0
BB
Sp2/0 B
死亡 死亡 存活
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18
杂交瘤细胞的筛选及克隆化
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19
克隆化：指将抗体阳性孔进行克隆化。目的是将抗体 分泌细胞、抗体非分泌细胞、特异性抗体分泌细胞和 无关抗体分泌细胞分开。 克隆化的原则：尽早进行，反复4-5次 克隆化方法：有限稀释法、软琼脂平板法、显微克隆 法 阳性杂交瘤细胞应及时冻存，防染色体丢失、变异及 污染
1 234567
增 加 抗 原 的 表 面 积 ， 可促进淋巴细胞之
使 抗 原 易 于 被 巨 噬 间的接触，增强辅
细胞吞噬
助T细胞的作用
可提高机体 初次和再次 免疫应答
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35
检验医学诊断试剂
病原微生物抗原、抗体的检测 肿瘤抗原的检测 免疫细胞及其亚群的的检测 激素测定 细胞因子的测定
交联葡聚糖凝胶(Sephadex）
琼脂糖凝胶(Sepharose)
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离子交换层析法 DEAE纤维素：结合溶液中带负电荷的蛋白质，又称阴 离子交换剂 CM纤维素：结合溶液中带正电荷的蛋白质，又称阳离 子交换剂
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亲和层析法： • 将抗原（或抗体）连接到固相载体上，特异性吸附
常见抗肿瘤细胞毒剂：化疗药物、细菌毒素、 植物毒素或放射性同位素等。 这不仅提高了抗体的疗效，也可降低细胞毒剂 对正常细胞的毒性反应。
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细胞内DNA的生物合利合成用成糖核途和苷氨酸径基，酸进
而合成DNA
主要生物 合成途径
叶酸拮抗物氨基蝶 呤可阻断主要途径
甲氨喋呤
补救途径
次黄嘌呤
HGPRT+ 次黄嘌呤 核苷酸
胸腺嘧啶 TK+
胸腺嘧啶
脱氧核苷酸
DNA
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• 小鼠HGPRT-骨髓瘤细胞（Sp2/0）
• 融合后的细胞在HAT选择培养基中结局
33
作为研究工作中的探针
利用单克隆抗体的特性可把它作为研究工作中的探针。此时， 可以从分子、细胞和器官的不同水平上，研究抗原物质的结 构与功能关系，进而可以从理论上阐明其机理。 例子：用荧光物质标记单抗作为探针，能快速地确定与其结 合的相应生物大分子在细胞中的位置和分布。
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增强抗原的免疫原性
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5 第五部分
展望
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展望
对异源性单抗进行改造及人源 性单抗的研制成为单抗的重要 研究方向
单克隆抗体的这些特性使 得它成为治疗学上的热点
最突出的问题是如何降低单抗的免 疫原性，单抗的异源性所引起的抗 体反应，不但降低了单抗的效价， 而且会给患者带来严重的后果。
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作为检验医学实验室的诊断试 剂，单克隆抗体以其特异性强、 纯度高、均一性好等优点，广 泛应用于酶联免疫吸附试验、 放射免疫分析、免疫组化和流 式细胞仪等技术。并且单克隆 抗体的应用，很大程度上促进
了商品化试剂盒的发展。
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农兽药快速检测
农兽药属于小分子物质，半抗原，无免疫原性，不 能刺激动物产生抗体，必须先将其制备成人工抗原， 以人工抗原免疫动物，使动物的免疫系统发生应答反 应，从而制备出对该农药具特异性的多或单克隆抗体 国外已制备多种农兽药单克隆抗体并应用于农药和兽 药残留的免疫分析。
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序目 前 常 用 的 免 疫 程
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细胞融合和选择性培养
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融合过程中，常采用聚乙二醇（PEG）作为融合诱导 剂。PEG促进细胞融合的机制可能是与临近细胞膜的水 分相结合使细胞间的水分被取代，降低细胞表面的极 性，导致脂质双分子层不稳定，引起细胞膜的融合 。
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感谢大家 请对不足之处提宝贵意见！
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作为免疫抑制剂
抗人T淋巴细胞单抗（McAb）作为一种新型免疫抑制剂，已 广泛应用于临床治疗自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反应， 其作用机理有赖于McAb的种类及其免疫学特性。 例子：对于同种骨髓移植的供体骨髓，在体外经抗T细胞单 抗加补体处理，能够减轻移植物抗宿主病的发生。
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液相中的抗体（或抗原），形成抗原抗体复合物， 然后改变条件，使抗原抗体复合物解离洗脱出纯化 的抗体（或抗原）。 • A蛋白-Sepharose CL 4B
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4 第四部分 单克隆抗体的应用
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单克隆抗体的应用
农兽药的快速检测 检验医学诊断试剂
作为亲和层系的配体
作为生物治疗的导向武器
单克隆抗体的制备及应用
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目录
1 单克隆抗体的简介 2 单克隆抗体技术发展经历 3 单克隆抗体的制备 4 单克隆抗体的应用 5 展望
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2
1 第一部分 单克隆抗体的简介
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3
单克隆抗体的简介
1975年分子生物学家G.J.F.克勒和C.米尔斯坦在自然杂交技 术的基础上，创建立杂交瘤技术。他们把可在体外培养和无 限增殖的骨髓瘤细胞与经抗原免疫后的纯系小鼠脾细胞融合， 形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞既具有瘤细胞易于在体外 无限增殖的特性，又具有脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性 抗体的特点。
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免疫动物的选择：一般的杂交瘤生产都选用BALB/c 小鼠或LOU/c大鼠作为免疫动物。但是，有时为了特 殊目的而需进行种间杂交，则可免疫其他动物。就小 鼠而言，初次免疫时以8-12周龄为宜，雌性鼠较便于 操作。
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免疫程序的确定：在设计免疫程序时，应考虑到抗原 的性质和纯度、抗原量、免疫途径、免疫次数与间隔 时间、佐剂的应用及动物对该抗原的应答能力等。没 有一个免疫程序能适用于各种抗原。
应用
作为免疫抑制剂
增强抗原的免疫原性
作为研究工作中的探针
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作为亲和层系的配体
单克隆抗体能与其相应的抗原特异性结合，因 而能能够从复杂系统中识别出单个成分。只要 得到针对某一成分的单克隆抗体，固定在层析 柱上，通过亲和层析，即可从复杂的混合物中 分离、纯化这一特定成分。
优点：与其他提取方法相比，具有简便、快速、 经济、产品活性高等优点。
血清 ｜ 50%饱和度硫酸胺
上清 （清蛋白）
沉淀（球蛋白） ｜ 33%饱和度硫酸胺
上清 拟球蛋白
沉淀 r球蛋白
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凝胶过滤法：干燥的凝胶颗粒吸水后形成了多孔胶粒，将蛋白 质溶液加在凝胶柱上进行洗脱时，大分子蛋白不能穿过凝胶网 孔进入。胶粒内，留在胶粒间隙的溶液中，随洗脱液最先流出， 小分子蛋白可穿过凝胶网孔进入胶粒内，受到凝胶的阻留，向 下移动较慢洗脱出来较慢，据此将不同大小的蛋白质分离出来。
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蛋白质提纯
先用待提纯蛋白质制成单抗，再将单抗固定在惰性固相 基 质上，制成层析柱。而后倒入混合液，当混合液流经单抗时， 相应的蛋白质与单抗特异性结合，杂质则随洗脱剂流走。再 用特殊的洗脱剂将蛋白质洗脱下来，则可将蛋白质提纯。
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在亲和层析中单克隆抗体 是主要的配体
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作为生物治疗的导向武器
人源化单克隆抗体
人源化抗体就是指抗体的可变区部 分或抗体全部由人类抗体基因所编 码。人源化抗体可以大大减少异源 抗体对人类机体造成的免疫副反应。
其抗体的可变区和 嵌合性单克隆抗体是指同时具有人和恒鼠定的区来都是人源的， 源构成，通常是30%比70%。鼠源部去分除用免来疫原性和毒 结合抗原，人源部分用来诱导产生疗副效作。用。 。
嵌合性单克隆抗体 全人源单克隆抗体
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3 第三部分 单克隆抗体的制备
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单克隆抗的制备
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动物免疫
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细胞融合和选择性培养
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杂交瘤细胞的筛选及克隆化
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大量制备及纯化
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单克隆抗体制备的简易流程
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动物免疫
抗原制备：制备单克隆抗体的免疫抗原，从纯度上说 虽不要求很高，但高纯度的抗原使得到所需单抗的机 会增加，同时可以减轻筛选的工作量。因此，免疫抗 原是越纯越好，同时应根据所研究的抗原和实验室的 条件来决定。一般来说，免疫用的抗原只需初步提纯 甚至不提纯，但抗原中混杂物很多，特别是如果这些 混杂物的免疫原性较强时，则必须对抗原进行纯化。
将单抗制成佐剂加在疫苗里，则可减少疫苗接种时药物的用量和避免多次接种并 不能引起机体更好地产生免疫应答，从而减少疫苗接种的风险。佐剂的作用机理：
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
改变抗原的物理性状，可 使抗原物质缓慢地释放， 延长了抗原的作用时间
佐剂能刺激 吞噬细胞对 抗原的处理
可刺激致敏淋巴细 胞的分裂和浆细胞 产生抗体
改变抗体的产生类型以 及产生迟发型变态反应， 并使其增强
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有限稀释法
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大量制备及纯化
大量制备
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纯化方法
1、盐析 2、凝胶过滤 3、离子交换层析 4、亲和层析法
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盐析：用中性盐使蛋白质沉淀析出的方法为盐析。大量的盐加入到蛋白溶液中， 高浓度的盐离子有很强的水化力，可夺取蛋白质的水化层，使蛋白质胶粒失水发 生凝聚而沉淀析出。
这种杂交瘤，通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克 隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗原决 定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（ mAbs ），简 称单抗。
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2 第二部分 单克隆抗体技术的发展经历
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单克隆抗体技术发展经历
鼠源性单克隆抗体
鼠源性单克隆抗体是来源于 鼠蛋白，因此对于人体而言 是外来物从而易被抵抗。
注意：PEG 的分子量和浓度与融合效果相关，PEG 的分子量越大，浓度越高，其促融率也越高，但其粘 度和细胞的毒性也随之增大；浓度低于30％时，融合 率低。
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HAT选择性培养 1964年Littlefield首先发明了HAT (H—Hypoxanthine次黄 嘌呤，A—Aminopterin甲氨喋呤，T—Thymidine 胸腺嘧 啶核苷) 选择性培养。 HAT选择性培养基是根据次黄嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸 生物合成途径设计的。
+ Sp2/0
B
Sp2/0 Sp2/0
BB
Sp2/0 B
死亡 死亡 存活
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杂交瘤细胞的筛选及克隆化
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克隆化：指将抗体阳性孔进行克隆化。目的是将抗体 分泌细胞、抗体非分泌细胞、特异性抗体分泌细胞和 无关抗体分泌细胞分开。 克隆化的原则：尽早进行，反复4-5次 克隆化方法：有限稀释法、软琼脂平板法、显微克隆 法 阳性杂交瘤细胞应及时冻存，防染色体丢失、变异及 污染
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增 加 抗 原 的 表 面 积 ， 可促进淋巴细胞之
使 抗 原 易 于 被 巨 噬 间的接触，增强辅
细胞吞噬
助T细胞的作用
可提高机体 初次和再次 免疫应答
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检验医学诊断试剂
病原微生物抗原、抗体的检测 肿瘤抗原的检测 免疫细胞及其亚群的的检测 激素测定 细胞因子的测定
交联葡聚糖凝胶(Sephadex）
琼脂糖凝胶(Sepharose)
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离子交换层析法 DEAE纤维素：结合溶液中带负电荷的蛋白质，又称阴 离子交换剂 CM纤维素：结合溶液中带正电荷的蛋白质，又称阳离 子交换剂
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亲和层析法： • 将抗原（或抗体）连接到固相载体上，特异性吸附