免疫比浊胶乳颗粒使用

胶乳微球使用中常见问题及解答

问：产品说明书中给出的胶乳粒径是平均粒径吗？

答：产品说明书中给出的胶乳粒径（Diameter）是平均粒径。

问：如何选择胶乳微球的粒径？

答：一般选择粒径小的胶乳微球，则需要的抗体量就多，精密度和线性相对较好，而选择粒径大的胶乳微球性，则所需抗体少，精密度和线性相对较差，相对于小球，大球的灵敏度较好。

问：一般情况下我们所使用的微球的浓度大概是多少？

答：整个测定体系中，微球的浓度大约在0.01%左右，当然这与试剂本身规定的线性有关系。

问：在使用离心方法偶联乳胶微球，一般需要多大的（相对）离心力？

答：需要多大的离心力和所使用的乳胶微球有关，一般70nm 左右的微球大概13000g/min 30min 以上，粒径越小所需时间越长，离心力越大。

问：蛋白（抗体）与微球偶联前，是不是微球的活化时间越长，效率越好？

答：羧基微球的活化所需时间很短，一般以10-20 分钟为宜，长时间的活化反

而会降低偶联效率。

问：由于抗体不只是FC 的氨基酸上有NH2，是不是表示它可以在任何方向与EDCA 活化微球偶联呢？如果是这样，是不是会影响抗体与抗原的特异性反应？答：事实的确如此，当然由于抗体的空间折叠方式和FC 端疏水性强，因此偶联反应的绝大多数发生在Fc 端，对抗体与抗原的结合的影响不大。

问：胶乳微球与抗体偶联后，当时没发现有凝集，但隔夜后发现有凝集，这是什么原因？如何控制和避免？

答：这种情况一般是偶联效率低的原因。当体系中蛋白不足或是其它原因，使微球表面在交联后还空出许多反应基团时，这些基团又可以与相连微球上的蛋白反应，结果是把球又拉在一起了，所以有聚集。可以加一些阻断剂解决,常见的是BSA，另外，也可提高微球的交联率。但为什么是过一段时间后才出现凝集呢，这是因为微球偶联上蛋白后，相互之间由于携带同种电荷的关系，比较稳定（所以能以胶体样存在），只有当偶尔相互碰撞，遇上彼此的反应基团时才能结合。

3、胶乳的自凝现象如何控制和避免？

答：胶乳自凝与许多因素有关，如高电解质浓度、表面价电荷被中和、或置于某些不利环境如冷冻时。如果电解质浓度升高到某一水平，使得表面的价负荷被掩蔽，胶乳微球之间发生接触，于是便产生凝集，故高离子强度的缓冲溶液不应使用，缓冲溶液的的浓度不要超过50mM，但有些CML 胶乳微球具有高电荷密度，则也能够耐受较高的离子强度。对负电荷胶乳微球，不能使用阳电荷的缓冲溶液如Tris 缓冲溶液，因为能使电荷中和而凝集。在长期贮藏时，悬浮介质的pH 值应至少保持在比胶乳微球表面基团的pKa 值高1-2pH 单位。高浓度的胶乳微球容易促使胶体不稳定，故胶乳微球的浓度尽量以低浓度为宜，胶乳微球也不能受冷冻，否则会凝集。

问：抗体偶联至羧基微球后，即时检测效果很好，但置于37 度 2 天后，抗体活性似乎下降很大，什么原因？

答：这种情况大概是以下情况所致：一、乳胶微球含有表面活性剂，导致胶乳自身出现自凝现象，可以通过显微镜进行观察，如果是胶乳含有活性剂，则在偶联之前进行清洗，保证偶联的胶乳微球没有聚集。二、如果共价结合反应是成功的而抗体活性失活如此迅速，最常见的原因是抗体质量差或试剂过期所致，而且还会出现一个自由流动白色粉末、持续性团块等，这表表明试剂已被污染。

问：胶乳溶液用什么缓冲液多大离子强度保存稳定性最好？

答：一般常用的是低浓度的Goods 缓冲液，如MOPSO、MES、HEPES 等缓冲液，浓度在25-50mmol/L。

问：胶乳微球偶联抗体后与抗原进行反应，但是反应不明显，是什么原因所致？答：⑴抗原和抗体不匹配；⑵包被的抗体量下足；⑶抗体使用量虽多，但偶联效率低。

问：如何选择胶乳试剂的波长？

答：胶乳试剂随着检测波长的增加吸光度降低，为了保证试剂检测过程中不超过吸光度的检测限，一般胶乳试剂的波长选择在546-600nm 左右。

微球表面基团种类及其反应

共价结合胶乳微球的参考方法

A. 一步法

1. 配制50 mM 的MES 反应缓冲溶液，pH 值为6.0；

2. 将蛋白质溶解于反应缓冲溶液中，其浓度为10mg/ml；

3. 用反应缓冲溶液稀释胶乳微球，使其浓度为1%（W/V）；

4. 将上述蛋白质溶液与胶乳微球混和，混和后在室温培育20 分钟；

5. 用去离子水配制EDAC 溶液，浓度为10 mg/ml（52μ mol/ml）；

6. 取计算量的EDAC 溶液加到蛋白质与胶乳微球混合液中；

7. 用0.1 M 氢氧化钠（NaOH）溶液调整该反应混合液的pH 值至6.5±0.2，在摇床室温培育 2 小时；

8. 将未结合的蛋白质除去，贮藏于缓冲溶液中。

B. 二步法简单二步法

1. 用反应缓冲溶液稀释胶乳微球，使其浓度为1%（W/V）；

2.1ml 胶乳微球悬浮液，加入20 mg EDAC，在室温培育40 分钟，在20 分钟后第二次加入20 mg/ml；

3.用相等体积的该缓冲溶液来洗涤胶乳微球，离心，用1 倍体积的缓冲溶液重复处理；

4.将蛋白质溶解于50-100mM 的MES 缓冲溶液中，蛋白质浓度为1mg/ml；

5.再将胶乳微球悬浮于去离子水或结合的缓冲溶液中，迅速加入溶解的蛋白质，37℃搅拌反应3 小时；

6.按1ml 反应混合液加入2.5 μ l 乙醇胺混合，搅拌反应10 分钟；

7.除去未结合的蛋白质，贮藏与贮存的缓冲溶液中。

生成NHS-酯的中间体二步法

1.每ml 反应混合物加入下列各物：

a.去离子水是最后容积为1.0 ml；

b.0.1 ml 的10x 的贮备缓冲溶液，其pH 值为6.0-6.5（一般可用0.5 M MES

缓冲溶液）；胶乳微球最终浓度为1%（W/V）；