代谢组学在植物研究中的应用_顾渝娟

代谢组学在植物研究中的应用

顾渝娟1，2，吴振先2

（1.广东检验检疫技术中心，广东广州510623；2.华南农业大学园艺学院，广东广州510230）

摘要：对代谢组学的概念、分析技术及原理进行了介绍，重点对核磁共振技术、色谱-质谱联用技术进行了阐述，并对其在植物生理、植物鉴定与转基因植物鉴别、植物代谢途径、功能基因组及基因工程中的应用进行了阐述，最后对其发展前景进行了分析。

关键词：代谢组学；技术；植物研究

中图分类号：S682.32文献标识码：A文章编号：1004-874X（2012）04-0105-03

自20世纪末基因组学概念提出以来，涌现出200多种“组学”，其中人们关注最多的为转录组学、蛋白质组学和代谢组学。按照“中心法则”，基因转录出mRNA经修饰后翻译成多肽链，通过相关酶的剪切修饰和组装形成以各种酶为主的蛋白质，后者发挥各自的生物学功能，催化或协助底物形成代谢物。生物信息从基因组到代谢组的传递实现了遗传物质和环境因素对个体生长、发育、衰老的调控。由于代谢组学能更直观、更有效地帮助人们了解生命现象揭示生命本质，因此在各个研究领域中得到了广泛应用。本文对代谢组学的概念、研究方法以及在植物研究中的应用进行阐述，以期为相关研究提供参考。

1代谢组学的概念

代谢组学作为一门新兴学科，国际上目前有两种观点：一是以Jeremy Nicholson为代表，在20世纪90年代提出的“metabonomics”，定义为“生命体系对生理、病理或遗传改造所产生的动态的、多指标的代谢物定量测定”。该概念主要强调通过核磁共振技术研究人或动物在疾病作用下总代谢物变化情况等相关领域；另一种是21世纪初由德国科学家Oliver Fiehn提出的“metabolomics”，即“全面、定量分析生物体系中所有的代谢物”，主要运用色谱-质谱联用技术对植物和微生物进行研究。虽然两种定义在拼写和侧重点上有所区别，但本质上都是研究生物代谢产物，统称为“代谢组学”。目前对代谢组学的定义为“对某一生物、组织或细胞所有低分子量代谢产物进行定性和定量分析的一门科学。其任务在于检测和量化生物体内各种代谢物组分与含量及其变化规律，揭示生命现象和过程”[1]。

在生物体中，代谢组学与基因组学、转录组学、蛋白质组学有一定因果关系。基因组学研究反映了什么是可能发生的，转录组学和蛋白质组学研究将要发生和赖以发生的，而代谢组学揭示了正在发生的，真正实现了表型区别、差异表述和标志物的发现[2]。由于多数情况下，某个或某些酶浓度的变化对生物体性状和表型的影响不显著，因此仅从蛋白水平上分析其基因功能可行性不强。但基因和蛋白的表达对代谢产物的成分和浓度的影响很显著，且可通过仪器进行精密检测。由于代谢产物水平是由代谢途径中相关酶活性决定的，而酶的活性与生物体遗传背景及发育进程、生理和病理状态相关，因此代谢物能够直观地反映遗传背景（内因）和环境因素（外因）对生物体共同作用的结果。

2代谢组学分析技术及原理

代谢组学涉及到多学科、多技术的整合，尤其是物质的分离与鉴定技术、数据的分析比对方法等，目前应用面最广的是核磁共振和色谱－质谱联用两大主流技术平台。

2.1核磁共振技术

核磁共振(NMR)是磁矩不为零的原子核在外磁场的作用下自旋发生蔡曼分裂，共振吸收某特定的射频辐射的物理过程。其基本原理是将物体置于特殊的磁场中，用无线电射频脉冲激发物内某一特定原子核（主要为氢和碳原子），引起该原子核共振并吸收能量，在停止射频脉冲后该原子核按特定频率发出射电信号，并将吸收的能量释放出来，被体外的接受器收录，经电子计算机处理获得图像数据。该技术最初运用于医学诊断和药理毒理学方面，目前也被广泛用于植物代谢产物组学研究。其优势在于能对样品实现无损伤无偏向的检测，具有良好的客观性和重现性，样品不需繁琐的预处理。以氢原子为检测对象的1H-NMR对所有含氢化合物均有响应，能完成大多数化合物的检测。

目前，核磁共振被大量地运用于癌症病理、植物代谢组分检测中。Lindon等[3]利用该技术在疾病鉴别诊断、药物毒性研究、肠道菌群与宿主之间关系、饮食环境等因素对机体机能状态影响方面进行了广泛的探索。Ward等[4]采用1H-NMR研究了不同生态型拟南芥代谢物差异的相关性。Hyung-Kyoon等[5]用此方法通过对野生与转基因烟草代谢产物组分差别分析，实现了对转基因烟草的快速鉴定。但是，核磁共振的缺点是检测灵敏度相对较低，存在信号重叠、动态范围有限、无法同时测定浓度差较大的代谢产物等缺点[6]。

2.2色谱－质谱联用技术

色谱是利用物质在两相中吸附或分配系数的差异达到分离目的的一种分离方法，其优点在于能将复杂的混合物分离为各个有关的组分，逐个加以检测[7]。质谱通过将单一物质轰击成碎片，并收集碎片信号扫描成质谱图，与谱库比对实现对物质的鉴定。色谱与质谱联用实现了从物质

收稿日期：2011-12-06

基金项目：国家荔枝龙眼产业技术体系（CARS-33-14）

作者简介：顾渝娟（1981-），女，在读博士生，农艺师，E-mail：guyj

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广东农业科学2012年第4期105

分离到鉴定的整个流程。目前常用的色谱质谱为气-质联用（GC/MS）和液-质联用（LC/MS）。

GC/MS由于兼具气相色谱的高分辨率和质谱的高灵敏度，是生物样品中药品和代谢物定性定量的有效工具，被广泛应用于复杂组分的分离与鉴定。主要针对易气化、热稳定性强、分子量相对较低的化合物。质谱法是将被测物质离子化，按离子的质荷比分离，测量各种离子谱峰的强度而实现分析目的的一种分析方法。质量是物质的固有特征之一，不同的物质有不同的质量谱——

—质谱，利用这一性质，可以进行定性分析（包括分子质量和相关结构信息）；谱峰强度也与它代表的化合物含量有关，可以用于定量分析。Roessner等[8-9]对拟南芥叶片和马铃薯块茎中提取的极性和亲脂性代谢物进行了定性与定量分析，鉴定出近200种化合物。但GC/MS存在对难挥发性物质需衍生化处理、预处理过程繁琐、对热不稳定性物质鉴定困难等缺点。

LC/MS又称液相色谱-质谱联用技术，避免了样品前处理，由于其较高的灵敏度和动态范围，已被广泛运用到代谢组学的研究中。该技术以液相色谱作为分离系统，以质谱为检测系统。样品在质谱部分和流动相分离，被离子化后经检测器得到质谱图。已知化合物中约80%为亲水性强、挥发性低的有机物以及热不稳定化合物和生物大分子，这些化合物不适宜采用气相色谱进行分析，只能依靠液相色谱。随着联用技术的日趋完善，LC/MS逐渐成为最热门的分析手段之一。特别是在分子水平上可进行蛋白质、多肽、核酸的分子量确认，氨基酸和碱基对的序列测定及翻译后的修饰工作等，这在LC/MS技术产生之前是难以实现的。Capanoglu等[10]采用液相质谱检测了番茄酱中抗氧化性成分和代谢组成分的变化趋势，确定番茄酱制作过程中对其代谢物影响最重要的关键工艺过程。Sun 等[11-12]运用高效液相色谱分析了荔枝果皮褐变中几种重要酚类物质的变化趋势，并确定表儿茶素是多酚氧化酶的直接底物。

2.3其他分析技术

除上述两类分析技术外，毛细管电泳、电化学、飞行时间质谱（TOF）等分离与分析方法也逐步应用到代谢物的检测中。Keurentjes等[13]运用液相四级杆飞行时间质谱分析了野生型拟南芥代谢物差异，通过对一个重组自交系种群个体的2000多个质谱峰的数量性状分析，发现在75%的质谱峰信号中可检测到数量性状位点差异。由于大量的信号未在亲本中检测到，表明杂交后子代具有对代谢物进行修饰的巨大潜力。毛细管电泳和质谱联用（CE/ MS）与LC/MS相似，但前者分离速度和效率要快，是一个新的发展方向。此外，毛细管电泳激光诱导荧光法（CE/ LIF）灵敏度高，具有很好的开发前景。另外，傅立叶变化红外光谱（FTIR）、傅立叶变化离子共振质谱（FT-ICR-MS）等新技术设备也在该领域得到了应用。

3植物代谢组学研究

目前，植物代谢组学已由一个充满假想的概念演变成发展迅速、研究价值巨大的学术领域。与细菌和酵母仅包含数百种代谢物不同，已知的植物次生代谢产物已达约10万种[14-15]。但是，植物代谢组学研究目前仍处于起步阶段，在物种鉴定、转基因植物鉴别、代谢途径和基因功能研究等领域有广阔的应用前景。

3.1在植物生理研究中的应用

植物代谢物研究可追溯到20世纪80年代，1991年在美国化学协会研讨会上，刊登了一篇题为“Metabolic profiling of plant——

—A new diagnostic technique”的文章，成为植物代谢组学发展的里程碑。该文章描述了应用GC/ MS技术，分析了经4种不同类除草剂处理的大麦的响应代谢物。由于样品对不同除草剂所响应的代谢物差异明显，作者提出GC/MS可以作为一种快速指纹鉴定技术，不仅可对化合物进行分类，还能用于鉴定新的化合物。自此，大量的科研人员开始关注植物代谢物组学。Grossmann[16]建立了包括10个生测方法的除草剂作用方式的经典研究方法，系统监测植物在不同有机单位、不同发育阶段，不同代谢类型对供试化合物的反应，并提出了一个新的概念“生理组学”。通过对代谢组研究，不仅可了解植物在不同环境条件下的变化，还可研究同一植物不同部位或时期的代谢物成分及含量。

3.2在植物鉴定与转基因植物鉴别中的应用

在一定的环境条件下，植物代谢物具有稳定的成分和含量，因此代谢物可作为物种鉴定的重要依据。代谢组学在转基因植物和突变体也具有重要意义。大多数经基因修饰或敲出的个体缺乏明显的表型变化，可以通过代谢物含量加以区别。Raamsdonk等[17]发现酵母突变体与野生型在表型上无明显差异，但代谢产物差异明显。研究发现在转基因马铃薯上也发现了这一现象[8]，表明代谢谱可作为物种鉴定尤其是转基因个体鉴别的重要依据，是基因型与表型研究的重要手段。

3.3在植物代谢途径及功能基因组研究中的应用

随着对代谢组的深入了解，需要对代谢途径做进一步描述，理清该代谢途径中一系列的底物、中间产物、最终产物和关键酶，并阐明该途径中的调节机制和位点。Tiessen 等[18]用高效液相色谱方法研究了马铃薯块茎中淀粉合成途径，通过与野生型和转基因个体的比较，提出了一种新的淀粉合成机制，即马铃薯淀粉合成关键酶AGPase在离体的情况下其亚基会形成二聚体，使酶失活进而抑制淀粉合成。由于某一代谢物可能存在于多条代谢途径中，因此必须尽量多的掌握整个代谢途径的信息。虽然目前已经建立多个代谢途径数据库，但代谢途径是一个复杂的物质网络，仍需很长一段时间去完善和发掘。

随着基因分离与测序技术的普及，我们已获得了海量的基因序列数据，但真正了解其功能的少之又少，通过代谢物组分和含量研究基因功能已经成为一个新的趋势。代谢组学作为一种研究功能基因组学的有力手段，为我们提供了大量植物生化表型的特征信息。我们可通过整合、归纳与分类掌握上游基因的变化情况，尤其是通过对经过基因插入、基因敲除、基因沉默的个体进行代谢组学

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