叶绿素荧光原理与应用

叶片荧光的暗－光适应曲线
荧光猝灭
荧光猝灭就是荧光产额降低。 荧光猝灭就是荧光产额降低 。 一切使荧光 产额低于其最大值的过程， 产额低于其最大值的过程 ， 都被称为荧光猝灭 过程。对于不同荧光猝灭组分的分辨， 过程 。 对于不同荧光猝灭组分的分辨 ， 能够提 供关于光合机构功能状态的重要资料。 供关于光合机构功能状态的重要资料。 荧光猝灭可分两类： 荧光猝灭可分两类： 光化学猝灭， 一 、光化学猝灭，即由光化学反应引起的 荧光产额的降低，它有赖于氧化态Q 的存在。 荧光产额的降低，它有赖于氧化态QA的存在。 非光化学猝灭，即由非光化学过程， 二 、非光化学猝灭， 即由非光化学过程 ， 例如热耗散过程引起的荧光产额的降低。 例如热耗散过程引起的荧光产额的降低 。 它是 植物体内光合量子效率调节的一个重要方面。 植物体内光合量子效率调节的一个重要方面。
Fm’―光下最大荧光，在光适应状态下全部PSII 中心都关闭时的荧光强度，qp=0，qN≥O。Fm' 受非 光化学猝灭的影响，而不受光化学猝灭的影响。 Fo’―光下最小荧光，在光适应状态下全部PSII 中心都开放时的荧光强度，qp=1，qN≥0。为了使照 光后所有的PSII中心都迅速开放，一般在照光后和 测定前应用一束远红光（波长大于680nm，使用的 波长735nm，几秒钟）。 Fv― 黑 暗 中 最 大 可 变 （ variable） 荧 光 强 度 ， Fv=Fm-Fo。 Fv’―光下最大可变荧光强度， Fv'=Fm'-Fo'。
叶绿素荧光诱导动力学
当一片经过充分暗适应的叶片从黑 暗中转入光下后， 暗中转入光下后，叶片的荧光产额 会随时间发生规律性的变化， 会随时间发生规律性的变化，即 kautsky效应 效应， kautsky效应，典型荧光诱导动力学 曲线上几个特征性的点分别被命名 为O、I、D、P、S、M和T
叶绿素荧光诱导动力学曲线
非光化学猝灭涉及三个不同的机理： 非光化学猝灭涉及三个不同的机理： qE——依赖类囊体膜内外的质子浓度差 ， 暗弛豫的半时间 依赖类囊体膜内外的质子浓度差， qE 依赖类囊体膜内外的质子浓度差 min，快相。 t1/2<1min，快相。 qT——依赖状态1向状态2的转换，PS II的捕光复合体磷酸化 依赖状态1 II的捕光复合体磷酸化 qT 依赖状态 向状态2的转换， 脱离PS II， 从类囊体的基粒区迁移到间质片层区， ， 脱离 PS II， 从类囊体的基粒区迁移到间质片层区 ， 从而减 少 激 发 能 向 PS II 的 分 配 ， 增 加 激 发 能 向 PS I 的 分 配 ， min，中间相。它比qE qI小得多 强光下qE qI增加 qE和 小得多， qE和 增加， t1/2=8min，中间相。它比qE和qI小得多， 强光下qE和qI增加， qT受抑制 受抑制。 而qT受抑制。 qI——与光合作用的光抑制有关 ， 可变荧光与最大荧光比值 与光合作用的光抑制有关， qI 与光合作用的光抑制有关 的降低， 40min 慢相。 关于这后一种非光化学猝灭， min， 的降低 ， t1/2=40min， 慢相 。 关于这后一种非光化学猝灭 ， 有 三种假说。 假说一： 这种非光化学荧光猝灭起源于PS II的反 三种假说 。 假说一 ： 这种非光化学荧光猝灭起源于 PS II 的反 应中心， 部分PS II中心发生变化 虽然还能捕捉激发能， 中心发生变化， 应中心 ， 部分 PS II 中心发生变化 ， 虽然还能捕捉激发能 ， 但 不能进行光化学反应，而把能量变成热。假说二： 不能进行光化学反应，而把能量变成热。假说二：这种非光化 学荧光猝灭起源于PS II的天线色素 的天线色素， 学荧光猝灭起源于 PS II 的天线色素 ， 它通过非辐射能量耗散 消耗激发能，与叶黄素循环过程中生成的玉米黄素有关。 消耗激发能，与叶黄素循环过程中生成的玉米黄素有关。假说 这种非光化学荧光猝灭与D 三：这种非光化学荧光猝灭与D1蛋白的失活和降解有关
叶绿素荧光原理与应用
范 海
光合作用过程简介
光合膜上的蛋白复合体
光反应的电子传递 Z-scheme
叶绿素荧光的产生
叶绿素吸收光能的去向
光合机构吸收的光能有三个可能的去向： 光合机构吸收的光能有三个可能的去向： 光化学反应, 一 、 光化学反应 , 引起反应中心的电荷分离及后来 的电子传递和光合磷酸化,形成用于固定、 的电子传递和光合磷酸化,形成用于固定、还原二氧化 碳的同化力(ATP和NADPH),氮素还原，光呼吸等。 碳的同化力(ATP和NADPH),氮素还原，光呼吸等。 氮素还原 二、转变成热散失； 转变成热散失； 三、以荧光的形式发射出来。 以荧光的形式发射出来。 由于这三者之间存在此消彼长的相互竞争关系, 所 由于这三者之间存在此消彼长的相互竞争关系 , 以可以通过荧光的变化探测光合作用的变化( 以可以通过荧光的变化探测光合作用的变化(图1)。
(Fm’-Fs)/Fm’―作用光存在时PSII的实际的 量子效率(φPSII)，即PSII反应中心电荷分离的 实际的量子效率。 Fs是稳态荧光水平，Fm’是在作用光存在 时一个饱和光脉冲激发的荧光水平。计算这个 参数不需要准确测定Fo，不受Fo变化的影响。 PSII 实 际 的 电 子 传 递 的 量 子 效 率 这 个 参 数 [φPSII=(Fm’-Fs)/Fm’]不仅与碳同化有关，也与 光呼吸及依赖O2的电子流有关。
由于φPSII是PSII光化学反应的量子效率， 所以可以利用它计算非循环电子传递速率 （ETR）以及体内的总光合电子传递能力： ETR=φPSII×PFDa×0.5 PFDa是被吸收的光通量密度(光合有效辐 射µmol·m-2·s-1)，0.5代表光能在两个光系统间 的分配系数。如果假设入射到叶片表面的光能 平均有84%被叶片吸收，并且平均分配给两个 光系统，则上式可以写成： ETR=φPSII×PFD×0.84×0.5。
测定与Байду номын сангаас析
荧光测定和猝灭分析需要几种不同的光源： 1. 检 测 光 （ 调 制 光 ） ― 绿 光 ： 光 强 PPFD 小 于 10µmol·m-2·s-1，用于测Fo。 2. 作用光―通常用白光，用于推动光合作用的光 化学反应，光强可因实验目的不同而变化。 3. 饱 和 脉 冲 光 ― 通 常 用 白 光 ， 光 强 PPFD 大 于 3000µmol·m-2·s-1，确保QA全部还原，用于测Fm 和Fm'。 4. 弱远红光（或暗）―以便PSI推动QA 氧化，测 Fo'前使用。
基本步骤
在植物对各种环境胁迫响应的分子机理研究中， 为了获得未遭受任何环境胁迫的对照叶片的基本荧光 参数，首先需要让对照叶片经过一个充分的暗适应过 程。 首先，给一个经过充分暗适应的叶片照射检测光 ，经过一小段时间（1~2min）荧光水平稳定后得到 荧光参数Fo。接着，给一个饱和脉冲光，一个脉冲 后 关 闭 ， 得 到 荧 光 参 数 Fm， 于 是 得 到 荧 光 参 数 Fv/Fm(Fv=Fm-Fo)，即潜在的PS II的光化学效率
实际上, 实际上,以荧光形式发射出来的光能在数量 上是很少的,还不到吸收的总光能的3 上是很少的,还不到吸收的总光能的3%。 在很弱的光下, 在很弱的光下,光合机构吸收的光能大 97% 被用于光化学反应, 约 97 % 被用于光化学反应 , 2 . 5 % 被转变成 热散失, 被变成荧光发射出来； 热散失,0.5%被变成荧光发射出来； 在很强的光下， 当全部PSII PSII反应中心 在很强的光下 ， 当全部 PSII 反应中心 关闭时， 吸收的光能95 95% 97% 被变成热， 关闭时 ， 吸收的光能 95 % － 97 % 被变成热 ， 被变成荧光发射。 而2.5%－5.0%被变成荧光发射。
调制式荧光仪的作用原理
调制光用于叶绿素荧光测定和猝灭分析是 荧光测定的一个革命性进展。 荧光测定的一个革命性进展。在这样的系 统中，用于测定荧光的光源被调制， 统中，用于测定荧光的光源被调制，也就 是使用以很高频率不断开关的光源。 是使用以很高频率不断开关的光源。在这 样的系统中，检测器选择性放大， 样的系统中，检测器选择性放大，仅仅检 测被调制光激发的荧光， 测被调制光激发的荧光，就可以在田间条 件下， 件下，即在田间很强的太阳光存在的情况 下测定相对的荧光产额。 下测定相对的荧光产额。
表明PSII光化学效率的参数
Fv/Fm―没有遭受环境胁迫并经过充分暗适应的植物 叶片PSII最大的或潜在的量子效率指标，它是比较恒定 的，一般在0.80~0.85之间。有时，Fv/Fm也被称为开放 的PSII反应中心的能量捕捉效率。 Fv/Fo－ 是 Fv/Fm 的 另 一 种 表 达 方 式 ， Fv/Fo=(Fv/Fm)/(1-Fv/Fm)。Fv/Fo不是一个直接的效率指 标，但是它对效率的变化很敏感，一些处理引起的 Fv/Fo 变 化 的 幅 度 比 Fv/Fm 变 化 的 幅 度 大 得 多 ， 所 以 Fv/Fo在一些情况下是表达资料的好形式。 此 外 ， Fm/Fo 也 是 Fv/Fm 的 另 一 种 表 达 方 式 ， 因 为 Fm/Fo=(Fv+Fo)/Fo=Fv/Fo+1。
调制荧光技术把作用光信号与荧光信号区分开， 调制荧光技术把作用光信号与荧光信号区分开， 在测定时，给植物材料施加一个脉冲调制光束， 在测定时，给植物材料施加一个脉冲调制光束， 该脉冲光使植物叶片产生一个脉冲的荧光信号， 该脉冲光使植物叶片产生一个脉冲的荧光信号， 当有自然光存在时， 当有自然光存在时，检测到由脉冲调制光束诱 导出的脉冲荧光信号。 导出的脉冲荧光信号。 脉冲荧光信号的大小可以反映出叶片生理状况 ，由脉冲调制光束诱导出的脉冲荧光信号作为 光系统II光能利用效率大小的探针。 II光能利用效率大小的探针 光系统II光能利用效率大小的探针。
在照光的第一秒钟内，荧光水平从O 在照光的第一秒钟内，荧光水平从O上 升到P,这一段被称为快相； 升到P,这一段被称为快相； P,这一段被称为快相 在接下来的几分钟内，荧光水平从P 在接下来的几分钟内，荧光水平从P下 降到T 这一段被称为慢相。 降到T，这一段被称为慢相。 快相与PSII 的原初过程有关 快相与 PSII的原初过程有关 ， 慢相则 PSII 的原初过程有关， 主要与类囊体膜上和间质中的一些反应 过程包括碳代谢之间的相互作用有关。 过程包括碳代谢之间的相互作用有关。
荧光参数
关于各种荧光参数的命名和定义，在不同 关于各种荧光参数的命名和定义， 时期和不同作者的文章中很不一致。不同的资 时期和不同作者的文章中很不一致。 料一定对应荧光动力学曲线理解。 料一定对应荧光动力学曲线理解。
2.1 基础参数
Fo―有多种名称 ， 最小 （ minimal）、 基底 （ ground） 有多种名称， 最小（ 有多种名称 ） 基底（ ） 、 暗 （ dark）、 初 始 （ initial） 和 不 变 （ un） ） changed,constant） 荧光强度等 。 它是已经暗适应的光合 ） 荧光强度等。 机构全部PSII中心都开放时的荧光强度 ， qP=1，qN=0。 中心都开放时的荧光强度， 机构全部 中心都开放时的荧光强度 ， 。 绝大部分学者都认为， 荧光来自天线叶绿素 荧光来自天线叶绿素a 绝大部分学者都认为，Fo荧光来自天线叶绿素 Fi―荧光诱导动力学曲线 荧光诱导动力学曲线O-I-D-F-T中I水平的荧光强度 荧光诱导动力学曲线 中 水平的荧光强度 Fp―荧光诱导动力学曲线 荧光诱导动力学曲线O-I-D-P-T中P水平的荧光强度 荧光诱导动力学曲线 中 水平的荧光强度 Fs―荧光诱导动力学曲线 荧光诱导动力学曲线O-I-D-P-T中T水平的荧光强度 中 水平的荧光强度 荧光诱导动力学曲线 Fm―黑暗中最大（ maximum） 荧光 ， 它是已经暗适应 黑暗中最大（ 黑暗中最大 ） 荧光， 的光合机构全部PSII中心都关闭时的荧光强度 ， qP=0。 中心都关闭时的荧光强度， 的光合机构全部 中心都关闭时的荧光强度 。 这时所有的非光化学过程都最小， 这时所有的非光化学过程都最小 ， qN=0， 这是标准的最 ， 大荧光。 大荧光。