化学发光免疫分析法-自己整理
化学发光免疫分析法-自己整理
化学发光免疫分析法（CLIA）A、管式磁性微粒子化学发光免疫分析法：（竞争法：用标记抗原与待检抗原竞争性结合固相抗体，待检抗原与检测信号成反比）一、原理：本实验采用竞争法，酶标抗原与标准品抗原竞争抗体，标准品抗值越小。
例：A为一原浓度越大，结合到抗体上的酶标抗原越少，RLU越小，B/B种抗原小分子，有免疫反应性。
实验中采用竞争法对尿液中的A进行分析，使待测A、辣根过氧化物酶标记的A(A-HRP)在均相体系中与异硫氰酸荧光素（FITC）标记的兔抗A抗体（FITC-A抗体）发生竞争性免疫反应，再加入用羊抗FITC抗体包被的磁微粒，反应生成物结合在磁微粒上，在磁场经分离、洗涤后加发光底物，用冷光分析仪检测发光强度（RLU），测定尿液中A的含量。
二、仪器：1、Flash’n glow LB955 30 管全自动进样冷光分析仪(Berthold 公司);2、高速离心机(Beckman 公司), 转速13000 r/min3、磁性分离器(北京科美生物技术有限公司定制, 磁场强度2800 高斯)4、XW80 旋涡混合器(上海精科实业有限公司)5、试管12 × 60 mm(浙江拱东医用塑料厂)6、磁性微粒子(磁性分离剂, Adaltis公司)三、试剂1、A标准品2、A单克隆抗体3、A-BSA结合物4、抗FITC抗体包被的磁性微粒子（5mg/mL）5、FITC标记的A单克隆抗体6、HRP标记的A7、PBST 洗涤液(0.05mol/L PBS, 含0.05% Tween-20)8、分析缓冲液(0.05 mol/L 的PBS 缓冲溶液, pH 7.4, 含2.0%BSA、0.5 %的水解明胶、0.1%的Proclin-300)9、发光底物液(鲁米诺、过氧化氢和对碘苯酚溶液)实验用水为二次蒸馏水四、试剂处理1、用分析缓冲液为稀释液, 梯度稀释标准品；2、取A-BSA-HRP溶液, 以分析缓冲液为稀释液, 梯度稀释, 配制1:1000、1:2000、1:5000 的A-BSA-HRP 溶液,4 ℃保存. FITC-A单克隆抗体溶液的配制: 取FITC-A单克隆抗体溶液, 以分析缓冲液为稀释液,梯度稀释, 配制1:1000、1:2000、1:5000、1:10000、1:12000 的FITC-A单克隆抗体溶液, 4 ℃保存。
化学发光免疫分析
化学发光免疫分析的类型介绍更新：2012-05-16 12:26:51 | 来源：标签：化学发光反应参与的免疫测定分为以下几种类型：（一）化学发光酶免疫测定化学发光酶免疫测定（CLEIA）是采用化学发光剂作为酶反应底物的酶标记免疫测定。
经过酶和发光两级放大，具有很高的灵敏度。
以过氧化物酶为标记酶、以鲁米诺为发光底物、并加入发光增强剂以提高敏感度和发光稳定性。
应用的标记酶也可以为碱性磷酸酶，发光底物为dioxetane磷酸酯，固相载体为磁性微粒医学教|育网搜集整理。
（二）化学发光免疫测定化学发光免疫测定（CLIA），是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的一类免疫测定方法。
吖啶酯是较为理想的发光底物，在碱性环境中即可被过氧化氢氧化而发光。
用作标记的化学发光剂应符合以下几个条件：1.能参与化学发光反应。
2.与抗原或抗体偶联后能形成稳定的结合物试剂。
3.偶联后仍保留高的量子效应和反应动力。
4.应不改变或极少改变被标记物的理化特性，特别是免疫活性。
鲁米诺类和吖啶酯类发光剂等均是常用的标记发光剂。
（三）微粒子化学发光免疫分析该免疫分析技术有两种方法：一是小分子抗原物质的测定采用竞争法；二是大分子的抗原物质测定采用双抗体夹心法。
该仪器所用固相磁粉颗粒极微小，其直径仅1.0μm，这样大大增加了包被表面积，增加抗原或抗体的吸附量，使反应速度加快，也使清洗和分离更简便。
其反应基本过程：（1）竞争反应：用过量包被磁颗粒的抗体，与待测的抗原和定量的标记吖啶酯抗原同时加入反应杯温育，其免疫反应的结合形式有两种，一是标记抗原与抗体结合成复合物；二是测定抗原与抗体的结合形式。
（2）双抗体夹心法：标记抗体与被测抗原同时与包被抗体结合成一种反应形式，即包被抗体-测定抗原-发光抗体的复合物。
（四）电化学发光免疫测定电化学发光免疫测定（ECLI）是一种在电极表面由电化学引发的特异性发光反应，包括电化学和化学发光两个部分。
分析中应用的标记物为电化学发光的底物三联吡啶钌或其衍生N-羟基琥珀酰胺（NHS）酯，可通过化学反应与抗体或不同化学结构抗原分子结合，制成标记的抗体或抗原。
化学发光免疫分析
3
在血循环中，约99.5%的T3与TBG结合，但T3与TBG的亲和力明显低于T4；T3不与TBPA结合
参考范围：0.58—1.62 ug/dL 临床意义： T3升高：⑴见于甲状腺功能亢进的病人，轻型甲亢、早期甲亢、亚临床甲亢的变化较T4明显，适合轻型甲亢、早期甲亢和亚临床甲亢以及甲亢治疗后复发的诊断；T3型甲亢仅有T3和FT3升高； ⑵与T4一样，T3亦受TBG变化影响，但受影响程度不及T4。 T3降低： ⑴仅于较重甲状腺功能减退的病人，T3和T4均下降，轻型甲减T3不一定下降； ⑵重症全身性疾病状态或慢性病变可导致T3下降，多见于慢性肾功能不全、慢性心功能不全、糖尿病、心梗等疾病的患者。
参考范围：5.0—14.5ug/dl（CENTAUR） 临床意义： T4升高：⑴见于甲状腺功能亢进的病人，但轻型甲亢、早期甲亢、亚临床甲亢的变化未如T3明显； ⑵凡引起TBG升高的因素均可使T4升高，如妊娠、应用雌激素、葡萄胎、淋巴瘤、血卟啉病等；⑶药物如胺碘酮、含碘造影剂、β受体阻断剂、奋乃近、海洛因等 T4降低： ⑴见于甲状腺功能减退的病人，轻型甲减、亚临床甲减的变化较T3明显； ⑵缺碘性甲状腺肿可见T4降低或在正常低限，而T3正常； ⑶肾病综合征、肝功能衰竭、遗传性TBG缺陷症、肢端肥大症、重症全身性疾病状态等；⑷以及应用糖皮质激素、雄激素、生长激素、苯妥英钠等药物
血清FT3和FT4降低： ⑴甲减病人两者皆下降，但轻型甲减、甲减初期多以FT4下降为主；⑵低T3综合征仅有FT3下降； ⑶某些药物，如苯妥英钠、多巴胺、糖皮质激素也可使FT3和FT4降低。
临床意义：
T3、T4均升高：高TBG血症、甲亢、甲状腺激素不敏感综合征。 T4升高，T3正常或下降：家族性白蛋白异常性高T4血症；胰高血糖素瘤；药物普萘洛尔、胺碘酮、胆囊造影剂；全身性疾病、精神性疾病；苯丙胺成瘾；T4型甲亢、甲亢伴T4转换T3障碍。 T4正常，T3升高：T3型甲亢；甲减用T3或者其他甲状腺激素制剂替代治疗后 T4正常，T3下降：患有全身性疾病时；5’单脱碘酶活性下降；血皮质醇升高的各种情况；营养不良综合征。 T4下降、T3升高：医源性甲亢；甲状腺功能正常病人服用甲状腺激素制剂。 T4下降，T3正常：轻至中度甲减；碘缺乏；苯妥英钠、卡马西平。 T3和T4均下降：中至重度甲减；重症全身性疾病；低TBG血症；大剂量使用水杨酸制剂
化学发光标记免疫分析法
不同IgG浓度下CRET免疫传感器的荧光光谱。IgG浓度分别为：0 (a), 0.5 (b), 1 (c),1.5 (d), 2 (e), 2.5 (f), 3 (g), 3.5 (h), 及4 nM (i)。插入的曲线为荧 光强度比率（R=I425/I525）随浓度变化曲线
01 吖啶酯 Add your texts here
02 三联吡啶钌
03 鲁米诺及其衍生物 04 AMPPD
化学发光剂
吖啶酯:在碱性条件下被H2O2氧化时,发出波长为470nm 的光，具有很高的发光效率，其激发态产物N-甲基吖啶酮 是该发光反应体系的发光体。
化学发光剂
三联吡啶钌: [RU(bpy)3]2+是电化学发光剂，它和电子供 体三丙胺（TPA）在阳电极表面可同时失去一个电子而发生 氧化反应。
化学发光剂
电化学发光剂反应原理
化学发光剂
鲁米诺:化学名称为3-氨基邻苯二甲酰肼 鲁米诺发光原理
化学发光剂
AMPPD:化学名称为 3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧 酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐
AMPPD发光原理
标记技术
发光物标记 酶标记 元素标记
标记技术：将
化学发光剂的 分子与某些分 子结合，直接 或间接地测定 待测组分。通 过分析被标记 物来完成对待 测组分的测定
人体免疫球蛋白A检测
化学发光夹心法检测lgA装置：多毛细管玻璃板的微孔示意图
化学发光免疫分析检测IgA过程
化学发光强度和lgA浓度的关系
人体免疫球蛋白A检测 集束板与96孔板检测lgA的比较
冲洗后
（2） 加入碱 （pH>10）
发光
(完整版)荧光和化学发光免疫分析方法
荧光和化学发光免疫分析方法免疫分析是利用抗原抗体反应进行的检测方法，即利用抗原与抗体的特异性反应，应用制备好的抗原或抗体作为试剂，以检测标本中的相应抗体或抗原。
由于免疫的特异性结合，免疫分析方法具有很好的选择性，荧光免疫分析和化学发光免疫分析是其中典型的两种。
本文将对这两种免疫分析方法进行详细的介绍。
一、免疫免疫是指机体免疫系统识别自身与异己物质，并通过免疫应答排除抗原性异物，以维持机体生理平衡的功能。
免疫是人体的一种生理功能，人体依靠这种功能识别“自己”和“非己”成分，从而破坏和排斥进入人体的抗原物质，或人体本身所产生的损伤细胞和肿瘤细胞等，以维持人体的健康。
特异性免疫系统，是一个专一性的免疫机制，针对一种抗原所生成的免疫淋巴细胞（浆细胞）分泌的抗体，只能对同一种抗原发挥免疫功能。
而对变异或其他抗原毫无作用。
1、抗原1.1 抗原的定义抗原：是一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答（免疫原性），并能与相应抗体在体内或体外发生特异性结合的物质（免疫反应性）。
抗原一般为大分子物质，其分子量在10kD以上。
1.2 抗原的分类完全抗原：同时具有免疫原性和免疫反应性的抗原，如细菌、病毒、异种动物血清等。
半抗原：仅具有与相应抗原或致敏淋巴细胞结合的免疫反应性，而无免疫原性的物质。
如大多数的多糖、类脂及一些简单的化学物质，它们本身不具免疫原性，但当与蛋白质大分子结合后形成复合物，便获得了免疫原性，1.3 抗原的性质决定簇是指抗原分子表面的基团，它直接决定免疫学反映的特异性。
抗原通过抗原决定簇与相应淋巴细胞表面抗原受体结合，从而激活淋巴细胞，引起免疫应答，抗原也藉此与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合。
因此，抗原决定簇是被免疫细胞识别的靶结构，也是免疫反应具有特异性的物质基础。
2、抗体2.1 抗体的定义抗体：是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白。
2.2 抗体的结构抗体是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞特别是浆细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白，因其具有免疫活性故又称作免疫球蛋白。
化学发光免疫分析
化学发光免疫分析化学发光免疫分析，也称为化学发光法或发光免疫测定法，是一种高灵敏度和高特异性的生物分析技术。
它结合了免疫学、生物学和化学的原理，利用特异性抗体与其抗原（或其他生物分子）相互作用，通过化学反应使其辐射出光信号，从而定量地检测目标物质的存在和含量。
一、化学发光免疫分析原理化学发光免疫分析原理基于化学发光原理和免疫学原理。
化学发光原理就是将化学反应的能量通过光子的辐射转换为光的能量。
免疫学原理是利用特异性免疫反应来识别和区分不同的抗原或抗体。
化学发光免疫分析技术的基本步骤如下：1.选择特异性的抗体与目标物质的结合；2.引入辐射源激活化学发光前体（例如，过氧化物或二氧化硫酞）；3.目标物质与抗体发生结合后，释放了辐射源激活前体，使其进一步分解并产生化学发光；4.测定样品中的荧光强度，用于定量分析目标物质的存在和含量。
化学发光免疫分析发出的荧光信号对于抗原-抗体的结合非常敏感和特异。
比较常见的荧光标记物包括酶（如辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、荧光染料（如荧光素和荧光素衍生物）、金纳米粒子等。
二、化学发光免疫分析的应用化学发光免疫分析的应用涉及生物分子、环境污染、中药等领域。
下面将从这些不同应用领域来介绍化学发光免疫分析技术的具体应用。
1.生物分子分析生物分子分析是化学发光免疫分析技术的主要应用领域之一。
常见的生物分子包括蛋白质、核酸、糖等。
如免疫荧光分析技术可以快速、准确地分析细胞表面分子、内部生物分子和变态反应特异性IgE。
同时，化学发光免疫分析技术可以用于患者体液中的特定免疫球蛋白或蛋白质的定量检测。
2.环境污染分析环境污染分析是化学发光免疫分析技术的另一个主要应用领域。
通过测量土壤、水、空气等样品中的污染物含量，可以快速精准地确定其存在和含量。
化学发光免疫分析技术可用于检测重金属、有机污染物、致癌物等。
该技术不仅检测灵敏，而且简便易行。
3.中药分析中药分析中常用的技术包括高效液相色谱法、气相色谱法、电化学法等。
化学发光免疫分析法报告
化学发光免疫分析法概述化学发光是物质在氧化还原过程中发光的现象。
能产生化学发光的物质称为化学发光剂。
化学发光免疫分析法是用化学发光剂包括发光物质或者发光反应催化剂等直接标记抗体或抗原的一类免疫测定方法。
将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应结合起来，藉以检测抗原或抗体的分析技术。
将发光物质或酶标记在抗原或抗体上，免疫反应后，通过化学发光反应来测定发光标记物或酶标记物的化学发光信号，从而确定待测抗原或抗体的浓度.化学发光免疫分析（chemiluminescence immunoassay，clia）兴起于20世纪80年代，由于方法成熟，目前已经成为临床免疫诊断的主要方法。
化学免疫分析是将化学发光或生物发光体系与免疫反应相结合，用于检测微量抗原或抗体的一种新型标记免疫测定技术。
临床上所用的化学发光试剂盒包含两个部分，即免疫反应系统和化学发光系统。
免疫反应系统，其基本原理同酶联免疫技术（elisa）。
根据标记物的不同可分为三大类:1.标记酶的化学发光免疫分析，其中应用最多的是三种酶：依据HRP-Luminol-H202-对碘苯酚(PIP)增强型化学发光反应体系进行检测的辣根过氧化物酶(HRP)；能催化AMPPD的分解反应从而产生化学发光进行抗原抗体定量分析的碱性磷酸酶(ALP)；另一种是虫荧光素酶，能催化氧化虫荧光素产生发光而实现对ATP、各种激素、药物以及抗原抗体的定量分析。
2.标记直接化学发光物质的化学发光免疫分析，最典型的是标记氨基异鲁米诺(ABEI)和吖啶酯类的化学发光免疫分析。
3.标记荧光物质，通过过氧化草酸酯化学发光体系进行检测的化学发光免疫分析。
按照标记反应的过程和形成结合物的结构特点，可以将标记分子分为“直接偶联”和“间接偶联”两种方式。
间接偶联可以在原有结构中引进新的活性基，增加反应活性。
下面就鲁米诺、光泽精等几种化学底物发光原理作一简要评述。
1 常见的发光物质1.1 鲁米诺和其衍生物鲁米诺（luminol）和其衍生物是最早在化学发光免疫分析中使用而且被临床较广泛应用的一种常用的化学发光物。
免疫化学发光法
免疫化学发光法免疫化学发光法是一种具有高灵敏度、高特异性的免疫分析方法，在生物医学领域得到了广泛应用。
下面是关于免疫化学发光法的各个方面的介绍。
1.直接法直接法是一种简单的免疫化学发光技术，通过将特异性抗体与发光标记物直接结合，形成免疫复合物，然后测定复合物发出的光强度，从而实现对目标分子的定量检测。
直接法的应用范围广泛，如肿瘤标志物、病毒和细菌等微生物的检测。
使用直接法时需要注意保证抗体的特异性，以及避免非特异性结合的影响。
2.间接法间接法是通过将特异性抗体与酶或化学发光物质结合，形成酶或化学发光标记的抗体，然后将该抗体与目标分子反应，形成免疫复合物，最后加入相应的底物或激发剂，根据发光强度实现对目标分子的定量检测。
间接法的灵敏度较高，适用于多种生物分子的检测。
需要注意的是，要确保抗体的特异性以及发光标记物的稳定性。
3.竞争法竞争法是一种免疫化学发光技术，通过将特异性抗体与目标分子和发光标记的竞争性抗体结合，形成免疫复合物，然后测定复合物发出的光强度，实现对目标分子的定量检测。
竞争法的应用范围包括激素、病毒和肿瘤标志物等生物分子的检测。
使用竞争法时需要注意保证竞争性抗体的特异性，以及避免非特异性结合的影响。
4.夹心法夹心法是一种免疫化学发光技术，通过将特异性抗体与目标分子和发光标记的抗体分别结合，形成夹心状的免疫复合物，然后测定复合物发出的光强度，实现对目标分子的定量检测。
夹心法的灵敏度较高，适用于多种生物分子的检测。
需要注意的是，要确保抗体的特异性和发光标记物的稳定性。
5.斑点免疫法斑点免疫法是一种将特异性抗体或抗原点状固定在支持物上的免疫分析方法。
在斑点免疫法中，待测样品中的目标分子与已固定的抗体或抗原相互作用，形成免疫复合物，然后加入发光标记物，形成点状发光。
通过测量发光强度，实现对目标分子的定量检测。
斑点免疫法的优点是灵敏度高、特异性强、操作简便，适用于多种生物分子的检测。
需要注意的是，要确保固定化抗体或抗原的特异性和稳定性。
化学发光免疫分析法-自己整理
化学发光免疫分析法（CLIA）A、管式磁性微粒子化学发光免疫分析法：（竞争法：用标记抗原与待检抗原竞争性结合固相抗体，待检抗原与检测信号成反比）、原理：本实验采用竞争法，酶标抗原与标准品抗原竞争抗体，标准品抗原浓度越大，结合到抗体上的酶标抗原越少，RLU越小，B/B o值越小。
例：A为一种抗原小分子，有免疫反应性。
实验中采用竞争法对尿液中的A进行分析，使待测A、辣根过氧化物酶标记的A（A-HRP在均相体系中与异硫氰酸荧光素（FITQ标记的兔抗A抗体（FITC-A抗体）发生竞争性免疫反应，再加入用羊抗FITC抗体包被的磁微粒，反应生成物结合在磁微粒上，在磁场经分离、洗涤后加发光底物，用冷光分析仪检测发光强度（RLU，测定尿液中A的含量、仪器:Flash ' n glow LB955管全自动进样冷光分析仪（Berthold公司）; 高速离心机（Beckman公司）,转速13000 r/min磁性分离器（北京科美生物技术有限公司定制，磁场强度2800高斯） XW80旋涡混合器（上海精科实业有限公司）试管12 X 60 mm®江拱东医用塑料厂）磁性微粒子（磁性分离剂,Adaltis公司）三、试剂1、A标准品2、A单克隆抗体•0——AFBi-BSA^HRP *：F!TC H AFB I +^4}抗FITCEFITC庐合別比FITCr^t I--r i詩玩FITC AFB1 FrrOAFBt^JMI 时fTC旳舸更片单丸垮序汗士体-F：障羊舍和料TJ5H笛箭♦—厲FR1 AF61^■ —FITC(- 歼ITC一餅3、A-BSA吉合物4、抗FITC抗体包被的磁性微粒子（5mg/mL）5、F ITC标记的A单克隆抗体6 HRP标记的A7、P BST 洗涤液L PBS,含% Tween-20）8、分析缓冲液mol/L的PBS缓冲溶液,pH ,含%BSA %的水解明胶、％的Procli n-300）9、发光底物液（鲁米诺、过氧化氢和对碘苯酚溶液）实验用水为二次蒸馏水四、试剂处理1、用分析缓冲液为稀释液，梯度稀释标准品；2、取A-BSA-HR溶液，以分析缓冲液为稀释液，梯度稀释,配制1:1000、1:2000、1:5000的A-BSA-HRP溶液,4 C保存.FITC-A单克隆抗体溶液的配制：取FITC-A 单克隆抗体溶液，以分析缓冲液为稀释液，梯度稀释，配制1:1000、1:2000、1:5000、1:10000、1:12000的FITC-A单克隆抗体溶液，4 C保存。
化学发光免疫分析法
化学发光免疫分析法
化学发光免疫分析法（Chemiluminescent Immunoassay，CLIA）是一种用于高
灵敏性和特异性检测抗原和抗体的分析方法。
它可以用于测定血清中和其他生物样品中的多种抗原和抗体，包括肿瘤抗原、抗生素和其他药物物质，也可用于研究免疫应答机制，因此在生物分析、临床诊断和科学研究中受到普遍的应用。
该分析法的原理是利用酶或其他生物分子介导的亲和免疫反应，一种特定的抗
原或抗体与抗原或抗体受体上的一种指定的抗体结合后，再加上一种特定的子细胞质因子，这种反应会产生化学发光。
由于这种反应发生的时间很短，后续过程不容易受到干扰，并且其发光参量也比一般的发光反应更高，因此检测结果具有高灵敏性和特异性。
CLIA结果的准确性和可靠性在生物分析的领域得到了认可，其快速、实用性、特异性和准确性为生物技术提供了更有力的保证。
它不仅普遍用于临床诊断，还可用于研究生物的抗原和抗体的交互作用，有助于更好地研究免疫应答机制和其他相关科学问题。
化学发光免疫分析技术原理简介(精)
化学发光免疫分析技术原理简介20 世纪60 年代即有人利用化学发光法测定水样中细菌含量和菌尿症患者尿液检查。
1977 年Halman 等将化学发光系统与抗原抗体反应系统相结合，创建了化学发光免疫分析法，保留了化学发光的高度灵敏性，又克服了它特异性不足的缺陷。
近年来对技术与仪器的不断改进，使此技术已成为一种特异，灵敏，准确的自动化的免疫学检测方法。
1996 年推出的电化学发光免疫技术，在反应原理上又具有一些新的特点。
这两种技术目前已在国内一些大型医院实验室用于常规免疫学检验。
一、化学发光免疫分析法化学发光免疫分析法( chemiluminescence immunoassay , CLlA) 是把免疫反应与发光反应结合起来的一种定量分析技术，既具有发光检测的高度灵敏性，又具有免疫分析法的高度特异性。
在CLIA中，主要有两个部分，即免疫反应系统和化学发光系统。
免疫反应系统与放射免疫测定中的抗原抗体反应系统相同化学发光系统则是利用某些化合物如鲁米诺( luminol) 、异鲁米诺(isolu-minol) 、金刚烷( AMPPD) 及吖啶酯( AE) 等经氧化剂氧化或催化剂催化后成为激发态产物，当其回到基态时就会将剩余能量转变为光子，随后利用发光信号测量仪器测量光量子的产额。
将发光物质直接标记于抗原(称为化学发光免疫分析)或抗体上(称为免疫化学发光分析) ，经氧化剂或催化剂的激发后，即可快速稳定的发光，其产生的光量子的强度与所测抗原的浓度可成比例。
亦可将氧化剂(如碱性磷酸酶等)或催化剂标记于抗原或抗体上，当抗原抗体反应结束后分离多余的标记物，再与发光底物反应，其产生的光量子的强度也与待测抗原的浓度成比例。
发光免疫分析的灵敏度高于包括RIA 在内的传统检测方法，检测范围宽，测试时间短，仅需30 - 60min 即可。
试剂货架寿命长，稳定性好，具有大规模自动化测试的功能。
这项技术发展很快，已有许多厂商生产各具特色的测定仪器与配套试剂。
化学发光免疫分析
化学发光免疫分析（Chemiluminescent Immunoassay，CLIA）介绍化学发光免疫分析（CLIA）是一种测定抗原和抗体的实验方法，它是一种特殊的免疫分析，可以用来测定血清中的抗原和抗体的含量。
CLIA的原理是利用抗原和抗体之间的特异性结合，将抗原和抗体结合在一起，然后将特异性结合物添加到一种特殊的化学发光物质中，当发生反应时，特异性结合物会产生发光，并且发光的强度与抗原和抗体的含量成正比。
因此，可以根据发光的强度来测定血清中的抗原和抗体的含量。
优势CLIA的优势在于它有很高的灵敏度和特异性，可以测定血清中抗原和抗体的含量，而且结果准确可靠，可以用于诊断疾病，比如癌症、HIV感染、肝炎等疾病。
此外，CLIA的操作简单，可以在实验室中快速完成，而且它还可以用于大量样本的检测，从而节省时间和成本。
应用CLIA可以用于多种疾病的诊断，比如甲状腺机能减退症（Hypothyroidism）、甲状腺功能亢进症（Hyperthyroidism）、慢性肝病（Chronic Liver Disease）、肝炎病毒感染（Hepatitis Virus Infection）、癌症（Cancer）、HIV感染（HIV Infection）等。
此外，CLIA还可以用于检测抗生素，如青霉素、氨苄西林、头孢菌素等，以及肝素、血清素等药物的含量。
结论CLIA是一种灵敏度和特异性很高的免疫分析方法，可以用来测定血清中抗原和抗体的含量，而且可以用于多种疾病的诊断，比如癌症、HIV感染、肝炎等疾病。
此外，CLIA的操作简单，可以在实验室中快速完成，可以用于大量样本的检测，从而节省时间和成本。
因此，CLIA可以作为一种有效的免疫分析方法，为疾病的诊断提供重要的帮助。
化学发光免疫分析方法.
为85.5％。Magliulo 等［20］建立了牛奶中黄曲霉毒素M1的化学发光酶
免疫分析方法，通过将黄曲霉毒素M牛血清白蛋白包被在聚丙烯板上，
通过酶标二抗在含有鲁米诺的基板上进行检测。该方法的最低检测限为
1 pg/mL，且板间板内数据的变异系数均低于9％，回收率在96％～
122％之间。 Lin 等［21］建立了农产品中黄曲霉毒素B1 的化学发光免 疫分析方法。该方法线性检测范围在0.05～10 ng/g 之间 ，检测灵敏度 为0.01 ng/g，板间及板内变异系数分别为12.2％及 10.0％。 农产品中样 品添加回收率在79.8％～115.4％之间。 同时， 将建立的分析方法与黄 曲霉毒素商品化酶联免疫试剂盒进行了相关性试验，相关系数为
菌素B1 的 ELISA 方法相比，其方法灵敏度提高了10 倍。 且通过样品的
添加回收率试验表明其有良好的回收率，其分析结果与ELISA 分析方法
与 HPLC 方法有良好的相关性。
Yang等［17］建立了食品中葡萄球菌肠毒素B（SEB）的碳纳米管的化
学发光免疫分析方法，通过将SEB 抗体吸附在碳纳米管表面 ， 然后将抗
方面报道还有Perschel 等［13］通过化学发光免疫分析对原发性醛固酮
过多症（PHA）进行快速筛选， Tudorache等［14］利用磁颗粒免疫支
持液膜方法（m-ISLMA）检测唾液中的孕酮含量，Iwata 等［15］利用双
夹心化学发光免疫分析方法测定血浆中内皮素－1的含量等。关于这方
面的应用，化学发光免疫分析方法应用的最为广泛，正是在医学检测方
种生物化学领域中最新的超灵敏的碱性磷酸酶底物，其特点是反应速度
快，在很短时间内提供正确可靠的结果。在它的分子结构中有两个重要
电化学发光免疫分析法电化学发光免疫分析法
化学发光 反应包括 两个关键 步骤，即 化学激发 和发光。
化学发光反应能级图
化学发光分析
• 根据化学发光反应在某一时刻的发光强 度或反应的发光总量来确定反应中相应 组分含量的分析方法，称为化学发光分 析。
方法评价
• “链霉亲和素-生物素”是是具有很强的非共 价相互作用的一对化合物，具有牢固而特 异的结合，应用此放大系统，使检测的灵 敏度大大提高；
方法评价
• 利用氧化铁的磁性，使用电磁场分离结 合态和游离态，方便迅速，实现了精确 的全自动化； • 标记物的再循环利用，使发光时间更长、 强度更高、易于测定。
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免疫分析法 发光和化学发光 化学发光免疫分析法 电化学发光 电化学发光是通过在电极上施 加一定波形的电压或电流信号进行电解 反应的产物之间或与体系中共存组分反 应产生化学发光的现象。
电致化学发光（ECL)
• ECL与CL的差异在于ECL是电启动发光反 应，而CL是通过化合物混合启动发光反 应。因此ECL反应易精确控制，具有灵活 性。
三联吡啶钌 （ [Ru(bpy)3]2+ ）特点
三联吡啶钌（ [Ru(bpy)3]2+ ）特点
• [Ru(bpy)3]2+衍生物与免疫球蛋白结合的分子 比超过20仍不会影响抗体的可溶性和免疫 活性； • [Ru(bpy)3]2+分子量小，空间位阻小 ，即便 小分子的核酸也能标记，使检测的菜单大 大丰富，更重要的是为其检测菜单的开发 前景提供了广阔空间。
ECLI原理
• 在电极表面由电化学引发的特异性化学发 光反应，用电化学发光剂三联吡啶钌 [Ru(bpy)3]2+标记Ab，通过Ag-Ab反应和磁珠 分离技术，根据三联吡啶钌在电极上发出 的光强度对待测的Ag或Ab进行定量/定性。
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化学发光免疫分析法（CLIA）
A、管式磁性微粒子化学发光免疫分析法：
（竞争法：用标记抗原与待检抗原竞争性结合固相抗体，待检抗原与检测信号成反比）
一、原理：本实验采用竞争法，酶标抗原与标准品抗原竞争抗体，标准品抗
值越小。
例：A为一原浓度越大，结合到抗体上的酶标抗原越少，RLU越小，B/B
种抗原小分子，有免疫反应性。
实验中采用竞争法对尿液中的A进行分析，使待测A、辣根过氧化物酶标记的A(A-HRP)在均相体系中与异硫氰酸荧光素（FITC）标记的兔抗A抗体（FITC-A抗体）发生竞争性免疫反应，再加入用羊抗FITC抗体包被的磁微粒，反应生成物结合在磁微粒上，在磁场经分离、洗涤后加发光底物，用冷光分析仪检测发光强度（RLU），测定尿液中A的含量。
二、仪器：
1、Flash’n glow LB955 30 管全自动进样冷光分析仪(Berthold 公司);
2、高速离心机(Beckman 公司), 转速13000 r/min
3、磁性分离器(北京科美生物技术有限公司定制, 磁场强度2800 高斯)
4、XW80 旋涡混合器(上海精科实业有限公司)
5、试管12 × 60 mm(浙江拱东医用塑料厂)
6、磁性微粒子(磁性分离剂, Adaltis公司)
三、试剂
1、A标准品
2、A单克隆抗体
3、A-BSA结合物
4、抗FITC抗体包被的磁性微粒子（5mg/mL）
5、FITC标记的A单克隆抗体
6、HRP标记的A
7、PBST 洗涤液(0.05mol/L PBS, 含0.05% Tween-20)
8、分析缓冲液(0.05 mol/L 的PBS 缓冲溶液, pH 7.4, 含2.0%BSA、0.5 %的水解明胶、0.1%的Proclin-300)
9、发光底物液(鲁米诺、过氧化氢和对碘苯酚溶液)
实验用水为二次蒸馏水
四、试剂处理
1、用分析缓冲液为稀释液, 梯度稀释标准品；
2、取A-BSA-HRP溶液, 以分析缓冲液为稀释液, 梯度稀释, 配制1:1000、1:2000、1:5000 的A-BSA-HRP 溶液,4 ℃保存. FITC-A单克隆抗体溶液的配制: 取FITC-A单克隆抗体溶液, 以分析缓冲液为稀释液,梯度稀释, 配制1:1000、1:2000、1:5000、1:10000、1:12000 的FITC-A单克隆抗体溶液, 4 ℃保存。
（具体分析）
五、数据处理
通过测量标准品和样品溶液的发光强度(RLU),使用Fl ash’n glow LB955 发光分析仪自带软件中的数据处理程序对测得的数据进行处理. 线性方程采用的是logit(Y)-log(X)的线性回归数学模型, 以logitY为纵坐标, logX为横坐标, 其线性方程表达式为logit(Y) = a + blog(X), 线性方程中 X 为标准品(或待测样品)溶液的浓度, logit(Y) =ln（y/1-y）,y=B/B0,式中, B 为标准品(或待测样品)溶液的发光强度, B0 为不加标准品(或待测样品)而加分析缓冲液的发光
强度. 根据标准品的浓度和发光强度值, 经线性回归得标准曲线, 代入样品的发光强度值得样品的浓度。
B、板式磁性微粒子化学发光免疫分析法（双抗体夹心法）：
一、原理：以磁性微粒子作为分离固相，96孔板为反应容器，辣根过氧
化物酶（HRP）催化H2O2-liminol化学发光体系作为检测体系。
采用双
抗体夹心法，在溶液中形成FITC-抗体—抗原-HRP复合物，引入偶联
FITC抗体的磁性微粒子，在反复施加磁场的作用下，通过洗涤将没有
结合的游离蛋白与免疫复合物分离，以辣根过氧化物酶（HRP）催化
H2O2-liminol化学发光体系作为检测体系，实现对待测抗原的检测。
二、仪器
1、BHP9504 微孔板化学发光分析仪(北京滨松光子技术有限公司,
北京);
2、管式发光分析仪(Berthold 技术有限公司, 德国);
3、DEM-III 型洗板机(北京拓普分析仪器有限公司, 北京); 电热
恒温水浴箱(北京长安科学仪器公司, 北京);
4、XW-80A旋涡式震荡混合仪(上海精科实业有限公司, 上海);
5、白色不透光96-孔微孔板(英科新创科技有限公司, 厦门);
6、磁分离器采用美国Promega公司的Magnabot 96 磁分离装置.
三、试剂
1、A标准品以及配对的A单克隆抗体均购自Fitzgerald 公司(康科
德, 美国);
2、辣根过氧化物酶(HRP)、异硫氰酸荧光素(FITC)以及Tween 20 购
自Sigma-Aldrich 公司(圣路易斯, 美国);
3、化学发光底物(鲁米诺和H2O2)来自美国的DPC 公司;
4、牛血清蛋白(BSA)购自德国的Merck 公司; 抗FITC 抗体包被的
磁颗粒悬浊液(粒径: 2.8 μm, 浓度: 5 mg/mL)购自意大利的
Adaltis公司.
5、96 孔微孔板先用300 μL含1% (w/V)的BSA 的磷酸缓冲液(PBS)在
4 ℃封闭12 h; 整个实验过程中的冲洗液为浓度是0.01 mol/L 的磷酸
盐缓冲液, 含0.05%吐温-20 (V/V).
6、正常混合人血清来自北京科美东雅生物技术有限公司, 所需血样来
自于解放军301 医院(北京)门诊及住院病人.
7、样品标本无需特殊处理, 采用常规医用技术收集全血, 静置, 离心
沉淀后, 吸取血清, 分装, 密封,－20 ℃保存备用. 检测前, 血清于室温平衡30 min 后,轻微摇晃使其混匀.
四、实验方法
具体操作步骤为: 先将25μL A标准品(梯度浓度稀释)或待测血清, 40μL HRP-A抗体结合物和40μL FITC-A 抗体结合物加入到96孔板的微孔内; 在37 ℃条件下温育70 min 后, 向体系中加入80 μL抗FITC 抗体包被的磁颗粒悬液; 再经过15 min的孵育后, 用96孔板专用磁分离器进行分离, 洗涤液清洗3次; 最后加入90μL鲁米诺和H2O2化学发光底物, 在室温下放置10 min 后进行发光测量.
C、对比
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