第四章-色谱分离法

聚酰胺色谱法
四、聚酰胺色谱法
聚酰胺色谱法是利用作为固定相的聚酰胺分子内 存在的许多酰胺基，能与酚类的羟基、酸类的羧基及
醌类的醌基形成氢键而产生吸附使混合物中各成分得 到相互分离的方法。
聚酰胺色谱法
聚酰胺是由酰胺聚合而成的一类高分子化合物。色谱分 离常用聚己内酰胺（绵纶6）和聚己二酰己二胺（绵纶66）， 其中聚己内酰胺可用结构式表示为：
阳离子交换树脂： RSO3ˉH＋+ Na＋Clˉ 阴离子交换树脂： RN＋OHˉ+ Na＋Clˉ
RSO3ˉNa＋+ H＋Clˉ
RN＋Clˉ+ Na＋OHˉ
具体选择离子交换树脂时，应综合考虑被分离物质所带 电荷种类及其解离能力强弱、分子的大小与数量。
离子交换色谱法
操作步骤
树脂的预处理 装柱 上样 洗脱 再生
活性炭色谱法
色 谱 技 术
聚酰胺色谱法 离子交换色谱法 大孔吸附树脂法 凝胶色谱法
薄层色谱法 纸色谱法 电泳技术 干柱色谱法 气相色谱法 高效液相色谱法
氧化铝色谱法
一、氧化铝色谱法
是利用作为固定相的氧化铝对混合物中各种成分吸附能力 的大小不同，使各成分得到相互分离的方法。 氧化铝是一种吸附力很强的亲水性吸附剂，有酸性、碱 性、中性三种规格。其吸附活性与含水量有关，随着含水量 的增加，吸附能力减弱。氧化铝的吸附能力大小，可根据含 水量用不同的活度级别来表示（见表4-1）
色谱分离法的基本原理
利用混合物中各成分在固定相和 移动相中吸附、分配及其亲和力的不 同，当两相作相对运动时，这些成分 在两相间进行反复多次的吸附或分配， 从而得到分离。
色谱分离法的基本原理
1、吸附色谱的原理
利用作为固定相的吸附剂对混合物中各种成分吸附能力 的大小不同，使各成分得到相互分离。 常用的吸附剂有：硅胶、氧化铝、聚酰胺和活性炭。 常见一些化合物官能团的极性大小顺序如下：
固定相
移动相
聚酰胺吸附色谱的原理
聚酰胺色谱法
聚酰胺与各种化合物形成氢键的能力不同，决定了聚酰 胺对其吸附力的强弱。 形成氢键的能力首先与溶剂的种类有关，在聚酰胺柱色 谱中常用作洗脱剂的各种溶剂洗脱能力顺序如下： 水＜甲醇或乙醇＜丙酮＜稀氢氧化钠液或稀氨溶液 ＜甲酰胺或二甲基甲酰胺＜尿素水溶液。
聚酰胺色谱法
硅胶色谱法
二、硅胶色谱法
是利用作为固定相的硅胶对混合物中各种成分吸附能力 的大小不同，使各成分得到相互分离的方法。 硅胶是一种微呈酸性的多孔性物质。常用SiO2·xH2O表示， 为硅氧烷交链结构：
O O O Si O Si OH O O
其骨架表面具有很多硅醇基，使硅胶能与许多化合物形 成氢键而产生吸附作用。
其次，与在含水溶剂中，化合物分子结构对氢键缔合的 影响有关，源自文库致如下：
（1）化合物分子中能形成氢键的基团数目越多，被聚酰 胺吸附越强。如：
OH > HO OH OH OH > OH
或
CH2COOH CH2COOH
>
CH3CH2CH2COOH
聚酰胺色谱法
（2）形成氢键的基团所处位置不同，被吸附的强度也不 同。如：
提示：
（1）离子交换树脂的选择：综合考虑被分离物质所带电 荷种类及其解离能力强弱、分子的大小与数量具体选择。 （2）树脂的交换容量及颗粒的大小：通常均选用交换容 量大的树脂。 （3）此法常用于分离具有解离能力的酸性、碱性及两性 化合物，如生物碱、氨基酸、有机酸、酚类、肽类等天 然药物化学成分。
大孔吸附树脂法
色谱分离法的基本原理
3、离子交换色谱的原理
利用离子交换树脂上的功能基能在水溶液中与 溶液的其他离子进行可逆性交换的性质，以离子交 换树脂作为固定相，使混合成分中离子型与非离子 型物质、或具有不同解离度的离子化合物得到分离。
色谱分离法的基本原理
4、凝胶色谱的原理
以凝胶作为固定相，选择适当的溶剂作为移动 相，随着移动相的流动，由于受凝胶颗粒中网孔半 径的限制，被分离试样中比网孔小的化合物可自由 进入凝胶颗粒内部，而比网孔大的化合物不能进入 凝胶颗粒内部被排阻，只能通过凝胶颗粒外部的间 隙，使混合物中分子量大小不同的化合物移动速率 不同而得到分离。
树脂两类；在水溶液中，前者能通过-SO3H、-COOH或 酚羟基中解离的H＋与溶液中的阳离子进行可逆性交换， 后者能通过伯、仲、叔、季铵基中解离的OHˉ与溶液 中的阴离子进行可逆性交换，而其本身却不溶于水、
酸、碱和有机溶剂。
离子交换色谱法
若以R代表离子交换树脂的母体，则其色谱分离的 基本原理可表示为：
基 本 知 识
（一）概念 （二）色谱分离法的分类
（三）色谱分离法的原理
（四）色谱分离法的应用
概
念
色谱分离法（Chromatography） 是一种分离、纯化和鉴定化合物的现 代理化分离分析方法。
色谱分离法的分类
依据
色谱分离原理 操作方式 固定相或支持剂种 类 移动相种类
分类
吸附色谱、分配色谱、离子交换 色谱、凝胶色谱、电泳技术等。 柱色谱、纸色谱、薄层色谱和毛 细管电泳色谱等。 氧化铝色谱、硅胶色谱、聚酰胺 色谱、凝胶色谱 气相色谱、液相色谱和超临界流 体色谱等。
离子交换色谱法
五、离子交换色谱法
是利用离子交换树脂上的功能基能在水溶液 中与溶液的其他离子进行可逆性交换的性质，以离 子交换树脂作为固定相，使混合成分中离子型与非 离子型化合物、或具有不同解离度的离子化合物得 到分离的一种色谱方法。
离子交换色谱法
离子交换树脂是一类含有解离性功能基团的特殊
高分子化合物，可分为阳离子交换树脂和阴离子交换
O H3C CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 C N H CH3
聚酰胺色谱法
H2 C N H O C CH2 H2 C CH2 H2 C CH2 H N C O H2 C H2 C CH2 H2 C C H N CH2 O HO H2 C CH2 O C N H CH2 H3C O H3C CH3 O CH3
六、大孔吸附树脂法
提示：
（ 1 ）硅胶的活化不宜在较高温度下进行，当温度升至 500℃ 时，硅胶失去吸附能力。 （2）有时硅胶色谱具有吸附色谱和分配色谱的双重性质，甚 至还有极弱的离子交换作用。
硅胶色谱法 提示：
（3）硅胶作为一种酸性、亲水性的吸附剂，适用于中性或酸 性成分的分离（包括非极性化合物和极性较小的化合物）， 如挥发油、黄酮、蒽醌、强心苷、皂苷、有机酸及酚性化合 物、氨基酸等。具有吸附容量高，机械强度好，分离范围广 等优点，应用最为广泛，但对碱性成分的分离不宜采用。
本章内容

概
述
基本知识 色谱技术

本章小结
概 述
如果天然药物的提取物中含有一些结构相似 、性质相近的化学成分，用一般分离方法无法获 得分离，那么，使用色谱分离法往往能获得较好 的分离效果。 色谱分离法具有试样用量少，分离效率高的 特点，是目前被广泛应用的分离纯化和鉴定化合 物的一种有效方法。具体应用时，可根据被分离 化合物的性质和各种色谱分离法的特点，选择合 适的色谱方法。
氧化铝色谱法
表4-1
活度等级
Ⅰ
Ⅱ Ⅲ Ⅳ
氧化铝活度与含水量关系
含水量% 氧化铝 0 5 15 25 38
Ⅴ
通过活化或去活化的操作得到不同活度级别的氧化铝， 一般在400℃左右加热6小时，即可得Ⅰ～Ⅱ级的氧化铝。
氧化铝色谱法
洗脱剂
操作步骤

（1）色谱柱的选择 （2）装柱 （3）上样 （4）洗脱 （5）氧化铝的再生
活性炭色谱法
三、活性炭色谱法
是利用作为固定相的活性炭对混合物中各种成分吸附能 力的大小不同，使各成分得到相互分离的方法。 活性炭是一种非极性吸附剂，具有较强的吸附能力， 其 吸附能力受溶剂的影响，在水溶液中的吸附力最强，在有机 溶剂中吸附力较弱。在一定条件下，对不同物质的吸附力也 有差别。
活性炭色谱法
第四章 色谱分离法
知识目标：
掌握各种色谱分离技术的特点及 适用范围。 理解色谱分离方法的基本原理。 了解色谱分离方法的分类。
能力目标：
能够熟练应用氧化铝色谱法、硅胶色谱法 、聚酰胺色谱法、离子交换色谱法、薄层 色谱法、纸色谱法对天然药物提取液进行 分离。 学会活性炭色谱法、凝胶色谱法、大孔吸 附树脂法、电泳技术、干柱色谱法、气相 色谱法和高效液相色谱法的操作技术。
OH > OH OH OH OH > OH
（3）分子中芳香核、共轭双键越多，被吸附强度越大。
如：
OH OH > OH >
聚酰胺色谱法
（4）化合物若能形成分子内氢键，则被吸附强度减小。 如：
HO
COOH
> O C O
OH
H
聚酰胺色谱法
操作步骤
装柱 上样 洗脱 聚酰胺粉的回收
提示：
（1）如果选用三氯甲烷装柱，为避免聚酰胺浮起，上样时 需放出柱底端的三氯甲烷层并立即上样，上样后顶端以棉
花塞紧。
聚酰胺色谱法 提示：
（2）聚酰胺色谱法常选用含水溶剂系统和非极性溶剂系统 两类溶剂系统进行分离。含水溶剂系统适用于各种苷类、 糖类、有机酸等水溶性成分的分离；非极性溶剂系统适用 于萜类、甾体、黄酮体苷元、酚类、醌类等极性不太高的
化合物的分离。
（3）此法常用于分离黄酮类、酚类、醌类等化合物，分离 效果好。对鞣质的吸附因几不可逆，则常用于粗提物中鞣 质的除去。此外，对生物碱、萜类、甾体、糖类、氨基酸 等成分的分离也有广泛的应用。因聚酰胺吸附容量大，故 特别适合于化合物的制备性分离。
对化合物的吸附力：
极性基团多的化合物＞极性基团少的化合物 芳香族化合物＞脂肪族化合物 分子量大的化合物＞分子量小的化合物
活性炭的分类：
粉末状活性炭 颗粒状活性炭 锦纶活性炭
活性炭色谱法
操作步骤
装柱 上样 洗脱
提示：
（1）此法适用于分离水溶性成分如氨基酸、糖类及某些苷类 等，具有试样上柱量大，分离效果好等特点，且活性炭价廉 易得，适用于大量制备性分离。 （2）目前尚无测定活性炭吸附力级别的理想方法，其吸附力 不易控制，故活性炭的具体应用受到一定的限制。
色谱分离法的应用
天然药物化学成分种类繁多，各有其特定的性质，可 选择不同的色谱方法进行分离。
化学成分
非极性成分 极性较大的成分
选用色谱
硅胶或氧化铝吸附色谱
分配色谱或弱吸附剂吸附色 谱 酸性、碱性、两性 离子交换色谱、吸附色谱、 成分 分配色谱
分子量大小有差异 的成分
凝胶色谱
氧化铝色谱法
硅胶色谱法
（卤烃） ＜ OCH3 ＜ COOR ＜ C O ＜ CHO RH ＜ RX （烷烃 ＜烯烃＜ 芳烃） ＜ SH ＜ NH2 ＜ OH ＜ Ar OH ＜ COOH
色谱分离法的基本原理
2、分配色谱的原理
利用混合物中各成分在互不相溶的两相溶剂中分配系数 的不同而获得分离。 两相溶剂中的一相需作为固定相，常以某种惰性固体 吸住该相溶剂，使之固定，这种吸着了固定相溶剂的固体 物质称为支持剂（也称载体或担体）。 另一相溶剂则作为移动相。
（4）在分配色谱中，常用的支持剂有硅胶、硅藻土、纤维素 粉和滤纸等。
硅胶色谱法 提示：
（5）以极性大的溶剂（如水或亲水性溶剂）为固定相，极性 小的溶剂为移动相的分配色谱称为正相分配色谱，常用于分 离极性较大的成分，如生物碱、糖类、苷类、有机酸等；而 以极性小的溶剂（如氯仿、石油醚等亲脂性有机溶剂）为固 定相，移动相溶剂却极性较大的分配色谱则称为反相分配色 谱，常用于分离极性小的成分，如油脂、高级脂肪酸、游离 甾体等。 （6）选择适当的溶剂系统，可提高分离的效率。常用纸色谱 摸索具体的分离条件，寻找合适的溶剂系统。
硅胶色谱法
表4-2 硅胶活度与含水量关系
活度等级
Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ
含水量% 硅胶
0 3 6 10 15
若含水量达17％以上，硅胶的吸附能力极弱，不能用 作吸附剂，可作为支持剂用于分配色谱。若将含水硅胶在 100～110℃温度下加热30分钟，能使硅胶恢复吸附能力。
硅胶色谱法
操作步骤
基本氧化铝色谱法基本相同。
混合物 （1+2+3） 1
2
3
氧化铝色谱法 提示：
（1）氧化铝适用于碱性或中性的亲脂性成分的分离，尤其 是对生物碱的分离应用最多。具有分离效果好，再生容易， 对杂质的吸附能力及分离试样的用量均优于硅胶等优点，但 对醛、酮、酯、内酯等类型化合物的分离不宜采用。 （2）柱色谱中氧化铝用前应过筛处理，使粒度均匀，常以 100目左右大小为宜。 （3）柱色谱中氧化铝的用量一般为样品量的20~50倍，如 果氧化铝对样品的吸附力较弱，则适当增加用量至100~200倍。