活菌计数
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194 2010, Vol. 31, No. 05
食品科学
※生物工程
发酵乳杆菌增殖培养基营养因子优化研究
叶雪飞，阮 辉，冯石开，朱承亮，何国庆 *
(浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江 杭州 310029)
摘 要：以 MRS 培养基为基础，选择碳源、氮源、生长因子这 3 个主要的营养成分进行单因素试验，然后利用 L9(34)正交试验优化出发酵乳杆菌增殖培养基营养因子最佳组成为：葡萄糖 2.0%，牛肉膏 0.5%，胰酶解酪朊 0.5%， 玉米浆 2%，其他 MRS 基本成分保持不变。研究结果表明，发酵乳杆菌 La-Y1 在优化后的 MRS 培养基中，37℃ 培养 16～18h，菌落数高于用原始 MRS 培养的发酵液，达到了 1010CFU/mL 以上。 关键词：发酵乳杆菌 La-Y1；营养因子；增殖培养基
本实验拟对一株从泡菜中筛选的产α - 半乳糖苷酶 发酵乳酸菌 La-Y1 的高密度培养进行初步探索，研究培 养基优化对 La-Y1 生长繁殖的影响，以期为今后研究发 酵乳杆菌高密度发酵提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂 发酵乳酸杆菌 La-Y1(Lactobacilus fermentumLa-Y1)，
浙江大学食品系实验室保藏。
玉米浆粉 山东省鲁森牧业开发集团；自制麦芽汁 ( 糖度 1 0 ～1 5 波美度)；胰蛋白胨、牛肉膏、乳清粉、 胰酶解酪朊、VC 等均为生化试剂；麦芽糖、蔗糖、海 藻糖、α - 乳糖、葡萄糖、CaCO3、K2HPO4、NaAc 等均为分析纯。 1.2 培养基[6]
活化培养基(均以质量分数计)： 脱脂奶粉 10%、蛋 白胨 3%、酵母提取物 5%、KH2PO41%、K2HPO4 1%； 基础培养基：MRS 培养基、ATP 培养基、S L 培养基、 T Y P 培养基；计数培养基：M R S 琼脂培养基。 1.3 仪器与设备
协同交互作用，采用正交试验法优化培养基成分。按 照 L9(34)设计正交试验，探讨最佳发酵培养基配方。以 37℃培养 16～18h 的活菌数作为观察指标，结果见表 2。
※生物工程
食品科学
2010, Vol. 31, No. 05 195
1.4 方法
1.4.1 菌种活化 将实验室保藏的发酵乳杆菌用活化培养基 37℃活化
数次，使种子液活力达 107CFU/mL，即得实验用的活化 菌种，活化后置 4 ℃冰箱保存备用。
1.4.2 发酵培养 将制备的种子液接种于发酵培养基(根据实验设计进
Abstract：In this study, the optimal basal medium and the optimal carbon source, nitrogen source and growth factor in it were
chosen for Lactobacilus fermentum growth, and the optimal addition amounts of the three nutrient factors were investigated using
ingredients. The number of living Lactobacilus fermentum cells was over 1010 CFU/mL after 16 h to 18 h of cultivation in optimized
MRS medium at 37 ℃, which exhibited a 10-fold increase compared with that in original MRS medium.
2.2.1 基础培养基的筛选
表 1 发酵乳杆菌 La-Y1 在 4 种培养基中的增殖情况 Table 1 Growth of Lactobacilus fermentum La-Y1 in different
culture media
培养时间 /h
9 12 18
MRS 1.7 × 109 2.1 × 109 1.6 × 109
活菌数 /(108CFU/mL)
60 50 40 30 20 10
0 植质蛋 胰酶 牛肉 聚蛋 胰蛋 硝酸 硫酸 白胨 解酪朊 膏 白胨 白胨 铵 铵
图 4 不同氮源对发酵乳杆菌 La-Y1 的影响 Fig.4 Effect of nitrogen source on Lactobacilus fermentum La-Y1
图 3 不同碳源对发酵乳杆菌 La-Y1 的影响 Fig.3 Effect of carbon source on Lactobacilus fermentum La-Y1 growth
从图 3 可以看出，发酵乳杆菌 La-Y1 培养一定时间 后，在加葡萄糖的培养基中活菌数能达到 109CFU/mL， 明显大于其他 4 种碳源，因此葡萄糖是最适合发酵乳杆 菌 La-Y1 生长的碳源。
培养 48h)。
2 结果与分析
2.1 发酵乳杆菌生长特性研究 生长曲线的研究，是为了分清楚 4 个生长时期，在
对数生长期进行接种，在稳定期进行取样计数，因为 菌种质量的优劣与其生理性状直接相关[8]。因此在确定 基础培养基之前，必须要了解菌种的生长过程，测定 生长曲线，从而掌握发酵最适收获期。
10
活菌数(lg(CFU/mL))
2.2.3 氮源的筛选 观察 7 种氮源(添加质量分数均为 1%)对发酵乳杆菌
La-Y1 的影响，结果如图 4 所示。使用有机氮源比无机 氮源更能促进乳酸菌的生长发育，这可能是与有机氮源培
196 2010, Vol. 31, No. 05
食品科学
※生物工程
养基营养更丰富有关。培养 16～18h 后发酵乳杆菌 La-Y1 在牛肉膏中生长最好，能到达 109CFU/mL。同时也发现 用胰酶解酪朊培养的菌落特别大，因此采用牛肉膏和胰 酶解酪朊作为氮源。
时间 /h
图 2 滴定酸度和 pH 值变化曲线
Fig.2 Acidity and pH change curves of during Lactobacilus
fermentum La-Y1 growth
由图 1 可知，发酵乳杆菌 La-Y1 0～4h 菌体数量增加 缓慢，处于生长延滞期，4～12h 活菌数增加很快，菌体 进入对数生长期，12～20h 为生长稳定期，此后菌体进 入衰亡期。在整个培养过程中，pH 值逐渐降低而后趋于 平稳，酸度逐渐升高而后趋于平缓(图 2)。这可能是因为 发酵乳杆菌 La-Y1 在发酵生长过程中不断分泌乳酸，而后 过量的乳酸抑制乳酸菌的生长，致使减少酸物质的产生。 2.2 发酵培养基的优化
orthogonal array design. Results indicated that MRS medium was the most suitable for Lactobacilus fermentum growth, and its
optimal formula consisted of 2.0% glucose, 0.5% beef extract, 0.5% casein peptone, 2% corn syrup, and other unchanged basic
Key words：Lactobacilus fermentum La-Y1；nutrient factor；growth culture
中图分类号：TS201.3
文献标识码：A
文章编号：1002-6630(2010)05-0194-03
发酵乳杆菌作为异型发酵乳酸菌，传统上多用于谷 物发酵。通过对不同的发酵乳杆菌菌株生理特征的研究 发现，发酵乳杆菌具有很多乳酸菌优良的特性[1-4]，在 国外发酵乳杆菌早已经列入益生菌类，应用于豆乳的发 酵，以消除豆乳中的胀气因子——α - 半乳糖苷类低聚 糖[5]。因此，作为乳品发酵的优良菌株来源，对发酵 乳杆菌进行高密度培养的研究具有重要意义。
行) ，3 7 ℃培养一定时间，即为制备的发酵液，用于各 指标的测定。
1.4.3 测定指标
1.4.3.1 酸度的测定 用浓度为 0.lmol/L NaOH 标准溶液滴定，以滴定酸
度( °T ) 表示[ 7 ] 。
1.4.3.2 pH 值测定 用 PHS-9V 型酸度计测定。
1.4.3.3 菌体浓度的测定 活菌计数法：梯度稀释后，平板计数(37℃，厌氧
9
8
7
0
5
10 15
20
25
时间 /h
图 1 La-Y1 的生长曲线
Fig.1 Growth curve of Lactobacilus fermentum La-Y1
滴定酸度 / οT
pH
140
滴定酸度
7
120
pH
6
100
5
80
4
60
3
40
2
20
1
0
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Optimization of Nutrient Factors in Medium for Lactobacillus fermentum Growth
YE Xue-fei，RUAN Hui，FENG Shi-kai，ZHU Cheng-liang，HE Guo-qing* (School of Biosystem Engineering and Food Science, Zhejiang University, Hangzhou 310029, China)
活菌数 /(109CFU/mL)
16 14 12 10 8 6 4 2 0
乳清粉
VC 麦芽汁 玉米浆粉
图 5 生长因子对发酵乳杆菌 La-Y1 的影响 Fig.5 Effect of growth factor on Lactobacilus fermentum La-Y1
growth
2.2.5 培养基营养因子优化正交试验 考虑到培养基碳源、氮源及生长因子之间可能存在
growth
2.2.4 生长因子的筛选 大多数乳酸菌是生长因子异养型微生物，需要从外
界提供其维生素等多种生长因子，虽然生长因子的需求 量很少，但它对乳酸菌的正常代谢必不可少，在促进 其生长方面起着重要的作用[10]。
在已优化好碳源和氮源的基础培养基中，分别添加 5% 麦芽汁、2% 乳清粉、0.1%VC、2% 玉米浆粉，接 种量 2%，于 37℃培养 16h。测定结果如图 5 所示，4 种物质都不同程度地提高了菌体浓度。但玉米浆的效果 较明显，在同样的条件培养下，菌体浓度最大，其后 依次是麦芽汁、乳清粉、V C 。因此选择玉米浆为最适 生长因子。
活菌数 /(CFU/mL)
ATP
SL
7.25 × 108 2.25 × 108
1.8 × 109
5.6 × 108
1.5 × 109
2.0 × 108
TPY 2.15 × 108 4.0 × 108 2.4 × 108
活菌数 /(108CFU/mL)
从表 1 可以看出，在 MRS、ATP、SL、TPY 这 4 种培养基中，MRS 和 ATP 都是比较适合发酵乳杆菌 La-Y1 生长的培养基，培养 12h 后活菌数都能达到 109CFU/mL。 本实验采用 MRS 为基础培养基，不仅因为培养 12h 后 MRS 中活菌数最多，而且培养 18h 以后 MRS 中活菌数 下降也最慢。
UV22120PC 型紫外 - 可见分光光度计 尤尼柯仪器 有限公司；OLYMPUS 光学显微镜 日本奥林巴斯仪器 有限公司；DH-8D 型恒温培养箱 上海一恒科技有限 公司；YQX-2 型厌氧操作台 上海新苗医疗器械制造 有限公司。
收稿日期：2008-04-30 基金项目：浙江省科技计划项目(2006C12095) 作者简介：叶雪飞(1983 —)，女，硕士，主要从事乳酸菌发酵研究。E-mail：candyye696@ * 通信作者：何国庆(1957 —)，男，教授，博士，主要从事食品微生物及发酵工程研究。E-mail：gqhe@
2.2.2 碳源的筛选 碳源的代谢速度常能影响到细胞的形成及初级和次
级产物的生成[9]。为了探讨不同种类的碳源对菌体浓度 的影响，在 MRS 培养基的基础上分别添加α- 乳糖、葡 萄糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖，质量分数均为 2.0%， 培养 16～18h，采用平板计数。
12 10 8 6 4 2 0
葡萄糖 蔗糖 海藻糖 麦芽糖 α- 乳糖
食品科学
※生物工程
发酵乳杆菌增殖培养基营养因子优化研究
叶雪飞，阮 辉，冯石开，朱承亮，何国庆 *
(浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江 杭州 310029)
摘 要：以 MRS 培养基为基础，选择碳源、氮源、生长因子这 3 个主要的营养成分进行单因素试验，然后利用 L9(34)正交试验优化出发酵乳杆菌增殖培养基营养因子最佳组成为：葡萄糖 2.0%，牛肉膏 0.5%，胰酶解酪朊 0.5%， 玉米浆 2%，其他 MRS 基本成分保持不变。研究结果表明，发酵乳杆菌 La-Y1 在优化后的 MRS 培养基中，37℃ 培养 16～18h，菌落数高于用原始 MRS 培养的发酵液，达到了 1010CFU/mL 以上。 关键词：发酵乳杆菌 La-Y1；营养因子；增殖培养基
本实验拟对一株从泡菜中筛选的产α - 半乳糖苷酶 发酵乳酸菌 La-Y1 的高密度培养进行初步探索，研究培 养基优化对 La-Y1 生长繁殖的影响，以期为今后研究发 酵乳杆菌高密度发酵提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂 发酵乳酸杆菌 La-Y1(Lactobacilus fermentumLa-Y1)，
浙江大学食品系实验室保藏。
玉米浆粉 山东省鲁森牧业开发集团；自制麦芽汁 ( 糖度 1 0 ～1 5 波美度)；胰蛋白胨、牛肉膏、乳清粉、 胰酶解酪朊、VC 等均为生化试剂；麦芽糖、蔗糖、海 藻糖、α - 乳糖、葡萄糖、CaCO3、K2HPO4、NaAc 等均为分析纯。 1.2 培养基[6]
活化培养基(均以质量分数计)： 脱脂奶粉 10%、蛋 白胨 3%、酵母提取物 5%、KH2PO41%、K2HPO4 1%； 基础培养基：MRS 培养基、ATP 培养基、S L 培养基、 T Y P 培养基；计数培养基：M R S 琼脂培养基。 1.3 仪器与设备
协同交互作用，采用正交试验法优化培养基成分。按 照 L9(34)设计正交试验，探讨最佳发酵培养基配方。以 37℃培养 16～18h 的活菌数作为观察指标，结果见表 2。
※生物工程
食品科学
2010, Vol. 31, No. 05 195
1.4 方法
1.4.1 菌种活化 将实验室保藏的发酵乳杆菌用活化培养基 37℃活化
数次，使种子液活力达 107CFU/mL，即得实验用的活化 菌种，活化后置 4 ℃冰箱保存备用。
1.4.2 发酵培养 将制备的种子液接种于发酵培养基(根据实验设计进
Abstract：In this study, the optimal basal medium and the optimal carbon source, nitrogen source and growth factor in it were
chosen for Lactobacilus fermentum growth, and the optimal addition amounts of the three nutrient factors were investigated using
ingredients. The number of living Lactobacilus fermentum cells was over 1010 CFU/mL after 16 h to 18 h of cultivation in optimized
MRS medium at 37 ℃, which exhibited a 10-fold increase compared with that in original MRS medium.
2.2.1 基础培养基的筛选
表 1 发酵乳杆菌 La-Y1 在 4 种培养基中的增殖情况 Table 1 Growth of Lactobacilus fermentum La-Y1 in different
culture media
培养时间 /h
9 12 18
MRS 1.7 × 109 2.1 × 109 1.6 × 109
活菌数 /(108CFU/mL)
60 50 40 30 20 10
0 植质蛋 胰酶 牛肉 聚蛋 胰蛋 硝酸 硫酸 白胨 解酪朊 膏 白胨 白胨 铵 铵
图 4 不同氮源对发酵乳杆菌 La-Y1 的影响 Fig.4 Effect of nitrogen source on Lactobacilus fermentum La-Y1
图 3 不同碳源对发酵乳杆菌 La-Y1 的影响 Fig.3 Effect of carbon source on Lactobacilus fermentum La-Y1 growth
从图 3 可以看出，发酵乳杆菌 La-Y1 培养一定时间 后，在加葡萄糖的培养基中活菌数能达到 109CFU/mL， 明显大于其他 4 种碳源，因此葡萄糖是最适合发酵乳杆 菌 La-Y1 生长的碳源。
培养 48h)。
2 结果与分析
2.1 发酵乳杆菌生长特性研究 生长曲线的研究，是为了分清楚 4 个生长时期，在
对数生长期进行接种，在稳定期进行取样计数，因为 菌种质量的优劣与其生理性状直接相关[8]。因此在确定 基础培养基之前，必须要了解菌种的生长过程，测定 生长曲线，从而掌握发酵最适收获期。
10
活菌数(lg(CFU/mL))
2.2.3 氮源的筛选 观察 7 种氮源(添加质量分数均为 1%)对发酵乳杆菌
La-Y1 的影响，结果如图 4 所示。使用有机氮源比无机 氮源更能促进乳酸菌的生长发育，这可能是与有机氮源培
196 2010, Vol. 31, No. 05
食品科学
※生物工程
养基营养更丰富有关。培养 16～18h 后发酵乳杆菌 La-Y1 在牛肉膏中生长最好，能到达 109CFU/mL。同时也发现 用胰酶解酪朊培养的菌落特别大，因此采用牛肉膏和胰 酶解酪朊作为氮源。
时间 /h
图 2 滴定酸度和 pH 值变化曲线
Fig.2 Acidity and pH change curves of during Lactobacilus
fermentum La-Y1 growth
由图 1 可知，发酵乳杆菌 La-Y1 0～4h 菌体数量增加 缓慢，处于生长延滞期，4～12h 活菌数增加很快，菌体 进入对数生长期，12～20h 为生长稳定期，此后菌体进 入衰亡期。在整个培养过程中，pH 值逐渐降低而后趋于 平稳，酸度逐渐升高而后趋于平缓(图 2)。这可能是因为 发酵乳杆菌 La-Y1 在发酵生长过程中不断分泌乳酸，而后 过量的乳酸抑制乳酸菌的生长，致使减少酸物质的产生。 2.2 发酵培养基的优化
orthogonal array design. Results indicated that MRS medium was the most suitable for Lactobacilus fermentum growth, and its
optimal formula consisted of 2.0% glucose, 0.5% beef extract, 0.5% casein peptone, 2% corn syrup, and other unchanged basic
Key words：Lactobacilus fermentum La-Y1；nutrient factor；growth culture
中图分类号：TS201.3
文献标识码：A
文章编号：1002-6630(2010)05-0194-03
发酵乳杆菌作为异型发酵乳酸菌，传统上多用于谷 物发酵。通过对不同的发酵乳杆菌菌株生理特征的研究 发现，发酵乳杆菌具有很多乳酸菌优良的特性[1-4]，在 国外发酵乳杆菌早已经列入益生菌类，应用于豆乳的发 酵，以消除豆乳中的胀气因子——α - 半乳糖苷类低聚 糖[5]。因此，作为乳品发酵的优良菌株来源，对发酵 乳杆菌进行高密度培养的研究具有重要意义。
行) ，3 7 ℃培养一定时间，即为制备的发酵液，用于各 指标的测定。
1.4.3 测定指标
1.4.3.1 酸度的测定 用浓度为 0.lmol/L NaOH 标准溶液滴定，以滴定酸
度( °T ) 表示[ 7 ] 。
1.4.3.2 pH 值测定 用 PHS-9V 型酸度计测定。
1.4.3.3 菌体浓度的测定 活菌计数法：梯度稀释后，平板计数(37℃，厌氧
9
8
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0
5
10 15
20
25
时间 /h
图 1 La-Y1 的生长曲线
Fig.1 Growth curve of Lactobacilus fermentum La-Y1
滴定酸度 / οT
pH
140
滴定酸度
7
120
pH
6
100
5
80
4
60
3
40
2
20
1
0
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Optimization of Nutrient Factors in Medium for Lactobacillus fermentum Growth
YE Xue-fei，RUAN Hui，FENG Shi-kai，ZHU Cheng-liang，HE Guo-qing* (School of Biosystem Engineering and Food Science, Zhejiang University, Hangzhou 310029, China)
活菌数 /(109CFU/mL)
16 14 12 10 8 6 4 2 0
乳清粉
VC 麦芽汁 玉米浆粉
图 5 生长因子对发酵乳杆菌 La-Y1 的影响 Fig.5 Effect of growth factor on Lactobacilus fermentum La-Y1
growth
2.2.5 培养基营养因子优化正交试验 考虑到培养基碳源、氮源及生长因子之间可能存在
growth
2.2.4 生长因子的筛选 大多数乳酸菌是生长因子异养型微生物，需要从外
界提供其维生素等多种生长因子，虽然生长因子的需求 量很少，但它对乳酸菌的正常代谢必不可少，在促进 其生长方面起着重要的作用[10]。
在已优化好碳源和氮源的基础培养基中，分别添加 5% 麦芽汁、2% 乳清粉、0.1%VC、2% 玉米浆粉，接 种量 2%，于 37℃培养 16h。测定结果如图 5 所示，4 种物质都不同程度地提高了菌体浓度。但玉米浆的效果 较明显，在同样的条件培养下，菌体浓度最大，其后 依次是麦芽汁、乳清粉、V C 。因此选择玉米浆为最适 生长因子。
活菌数 /(CFU/mL)
ATP
SL
7.25 × 108 2.25 × 108
1.8 × 109
5.6 × 108
1.5 × 109
2.0 × 108
TPY 2.15 × 108 4.0 × 108 2.4 × 108
活菌数 /(108CFU/mL)
从表 1 可以看出，在 MRS、ATP、SL、TPY 这 4 种培养基中，MRS 和 ATP 都是比较适合发酵乳杆菌 La-Y1 生长的培养基，培养 12h 后活菌数都能达到 109CFU/mL。 本实验采用 MRS 为基础培养基，不仅因为培养 12h 后 MRS 中活菌数最多，而且培养 18h 以后 MRS 中活菌数 下降也最慢。
UV22120PC 型紫外 - 可见分光光度计 尤尼柯仪器 有限公司；OLYMPUS 光学显微镜 日本奥林巴斯仪器 有限公司；DH-8D 型恒温培养箱 上海一恒科技有限 公司；YQX-2 型厌氧操作台 上海新苗医疗器械制造 有限公司。
收稿日期：2008-04-30 基金项目：浙江省科技计划项目(2006C12095) 作者简介：叶雪飞(1983 —)，女，硕士，主要从事乳酸菌发酵研究。E-mail：candyye696@ * 通信作者：何国庆(1957 —)，男，教授，博士，主要从事食品微生物及发酵工程研究。E-mail：gqhe@
2.2.2 碳源的筛选 碳源的代谢速度常能影响到细胞的形成及初级和次
级产物的生成[9]。为了探讨不同种类的碳源对菌体浓度 的影响，在 MRS 培养基的基础上分别添加α- 乳糖、葡 萄糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖，质量分数均为 2.0%， 培养 16～18h，采用平板计数。
12 10 8 6 4 2 0
葡萄糖 蔗糖 海藻糖 麦芽糖 α- 乳糖